[发明专利]适用于百合体胚组织miRNAs分析的RNA提取方法

摘要

本发明涉及一种适用于百合体胚发生过程中miRNAs分析的完整RNA提取方法，解决了百合属植物miRNAs提取产率低，提取质量差的难题，本方法尤其适用于百合体胚发生过程中愈伤组织及体细胞胚组织的完整RNA提取；RNA提取重复性好。通过不同发育阶段的体胚组织的RNA提取比较，可见RNA的含量及纯度均呈现出数值稳定的特点，表明该方法的稳定性很好。

主权项

1.适用于百合体胚组织miRNAs分析的RNA提取方法，其特征是：包括以下步骤：（1）外源RNase的去除及溶液的配制在RNA提取之前将各种型号的枪头、不同容量的离心管、PCR管及枪头盒浸泡在1‰DEPC水中，25℃浸泡处理24小时，用保鲜袋密封后放入高压灭菌锅内，121℃加热40分钟，灭菌后置于80℃烘箱内烘干，RNA提取所需的丝口瓶、三角瓶、研钵、研杵、药匙等工具需在180℃烘箱内高温处理8小时；（2）RNA提取所用药品配制CTAB提取液 (1000 mL) ：准确称取CTAB 20 g，PVP 20 g，NaCl 81.816 g，依次放入1000 mL烧杯中，加入800 mL超纯水，将烧杯置于磁力搅拌器上80℃助溶，1小时即可完全溶解，在上述溶解后的混合液中，加入12.114 g Tris，用38%浓HCl调pH值至8.0，然后再加入50.845 g EDTA，并用固体NaOH调pH值至8.0，待溶液温度自然降至室温后转入1000 mL的容量瓶中并用超纯水定容；最后将定容后的提取液转移到1000 mL丝口瓶内，121℃灭菌20分钟，密封好的CTAB提取液置于4℃冰箱内备用；3 mol/L NaAC (pH5.2，100 mL) ：准确称取无水NaAC 24.609 g溶解于80 mL超纯水中，用乙酸 (99.8%) 调节pH值至5.2，再转入100 mL容量瓶中定容，最后将配好的溶液转移到100 mL丝口瓶内，121℃灭菌20分钟，密封好的3 mol/L NaAC(pH5.2) 置于4℃冰箱内备用；70%乙醇 (100 mL) ：用100 mL量筒量取70 mL无水乙醇，倒入100 mL丝口瓶中，再量取30 mL DEPC水加入丝口瓶中，封好后置于-20℃冰箱里备用；氯仿∶异戊醇 (24∶1) 抽提液 (250 mL) ：用烘干处理后的500 mL量筒分别量取240 mL氯仿和10 mL异戊醇，于250 mL丝口瓶中混匀，置于4℃冰箱内备用；（3）提取液预热取CTAB提取液5 mL加入到50 mL离心管内，再向其中加入10μL巯基乙醇，然后将离心管置于65℃水浴锅预热20分钟；（4）植物样品研磨先用液氮对研钵、研杵和药匙进行快速冷却，然后取1 g百合胚性愈伤组织或体胚组织进行研磨，研磨过程中不断加入液氮以保证样品不软化，将样品磨至粉末状后转移至装有预热CTAB提取液的50 mL离心管中，立即涡旋震荡混匀；（5）RNA释放将上述50 mL离心管置于65℃水浴锅恒温加热20分钟，每隔5分钟取出涡旋震荡一次，最后一次涡旋震荡后将样品溶液分装到2 mL无RNase的离心管中 (每管900 μL)，再依次加入等体积的水饱和酚 (900μL，pH4.4)，1/5体积的3 mol/L NaAC (160μL，pH5.2)，对以上得到的每管混合液均涡旋震荡4分钟；（6）去组织残渣、蛋白质向上述混合液中加入1/3体积的氯仿 (300 μL)，并充分混匀，12,000 rpm离心8分钟；用移液枪小心将上清液 (约800 μL) 转移到新的2 mL无RNase离心管内，然后加入与上清液等体积的氯仿∶异戊醇 (24∶1) 抽提液 (800 μL)，涡旋混匀，12,000 rpm离心10分钟，将得到上清液继续用氯仿∶异戊醇 (24∶1) 抽提液反复抽提3次，直至抽提混合液的中间相变得清亮；（7）收集RNA将上清液 (约900 μL) 转入新的2 mL无RNase离心管中，加入等体积的异丙醇 (900 μL)，轻柔地颠倒混匀后置于-80℃超低温冰箱中冷冻1小时，12,000 rpm离心15分钟，弃上清，向管内加入-20℃预冷的1 mL70%乙醇，轻微涡旋洗涤沉淀的RNA，再经8,000 rpm离心5分钟，收集RNA；（8）RNA溶解保存离心后立即倒掉上清液体，将离心管敞口置于超净工作台内风干 (10分钟)，取30 µL超纯水溶解沉淀；（9）RNA纯化使用DNaseⅠ对所提总RNA中的DNA进行消化和纯化处理；（10）RNA质量检测A260/A280比值在1.9-2.1之间，且A260/A230比值大于2.0的RNA才能用于后续cDNA的合成。