[发明专利]一种测定重组人粒细胞集落刺激因子二硫键组成的方法

摘要

本发明的一种测定重组人粒细胞集落刺激因子二硫键组成的方法，属于蛋白质组学的技术领域。是利用LC‑Q‑Q‑TOF联用技术与“柱后在线还原法”相结合测定rhG‑CSF二硫键以及二硫键错配比例的方法。测试步骤有采用胃蛋白酶在缓冲液pH5.0的条件下对rhG‑CSF进行酶切、还原样品和未还原样品的LC‑MS检测、未还原样品的在线柱后还原液相色谱质谱联用检测。本发明直接在酸性条件下对rhG‑CSF进行酶解，省略变性和烷基化步骤使操作简洁，反应条件温和，重复性好，灵敏度高；搭配在线柱后还原法可显著降低数据分析难度；鉴定rhG‑CSF的二硫键和计算二硫键错配比例结果更可靠，实验过程更简洁，数据分析更高效。

主权项

1.一种测定重组人粒细胞集落刺激因子二硫键组成的方法，分为样品前处理、还原前和还原后酶解液的液相色谱质谱联用仪检测、还原前酶解液的在线柱后还原结合液相色谱质谱联用仪检测、确定二硫键连接方式、计算半胱氨酸错配比例五个步骤；所述的样品前处理，是将重组人粒细胞集落刺激因子原液使用胃蛋白酶进行水解，水解条件为pH值2.0～6.0的酸性环境，37℃水浴孵育16小时，得到酶解液；所述的还原前和还原后酶解液的液相色谱质谱联用仪检测，将酶解液取出一部分，使用三羧基乙基膦还原，将还原前和还原后的酶解液分别进行液相色谱质谱联用检测得到对应肽图；对比还原前后肽图的差异，找到还原后消失或显著降低的色谱峰，确定含有二硫键的肽段，记录含有二硫键肽段的一级质谱分子量和保留时间；所述的还原前酶解液用柱后还原法结合液相色谱质谱联用检测，是使流过液相色谱紫外检测器出口的还原前的酶解液与针泵的在线还原试剂混合后进入质谱进行检测，找到在柱后还原质谱数据中对应含二硫键肽段的保留时间处产生的新肽段，分析还原后新肽段的二级质谱数据；所述的在线还原试剂为二硫苏糖醇的氨水溶液；所述的确定二硫键连接方式，是采用质谱分析软件对二级质谱数据进行解析，分析差异、鉴定酶解肽段，最后确定二硫键连接方式；所述的计算半胱氨酸错配比例，是提取含有半胱氨酸的肽段并对峰面积进行积分，计算出每个半胱氨酸错配比例。