[发明专利]一种禽流感和新城疫病毒检测方法及其试剂盒

摘要

本发明涉及基因检测领域，具体而言，涉及一种禽流感和新城疫病毒检测方法及其试剂盒。用于检测禽流感和新城疫病毒的核酸序列，所述核酸序列为第一引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第一探针的核酸序列如SEQ ID NO：3所示；第二引物对如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，第二探针的核酸序列如SEQ ID NO：6所示。本发明提供的用于检测禽流感病毒的核酸序列，是针对禽流感病毒通检的片段进行多次试验设计得到的核酸序列，特异性强，稳定性好，为定量检测禽流感病毒提供良好的基础。本发明提供的检测禽流感与新城疫病毒的核酸序列，不同探针5′端标记不同的荧光报告基团，实现了同时检测这两种病毒的目的，节约检测成本，提高检测效率。 1

主权项

1.用于检测禽流感病毒的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列为第一引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第一探针的核酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述的用于检测禽流感病毒的核酸序列，其特征在于，所述探针为自身淬灭探针；

进一步地，所述探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记淬灭基团；

进一步地，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、VIC或JOE中的任一种；

进一步地，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ或MGB中的任一种。

3.用于检测禽流感与新城疫病毒的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括以下引物对及其对应的探针：

第一引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第一探针的核酸序列如SEQ ID NO：3所示；

第二引物对如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，第二探针的核酸序列如SEQ ID NO：6所示；

其中，不同探针的5′端标记荧光报告基团不同。

4.根据权利要求3所述的用于检测禽流感与新城疫病毒的核酸序列，其特征在于，所述第一引物对对应的第一探针的5′端标记荧光报告基团VIC；

所述第二引物对对应的第二探针的5′端标记荧光报告基团FAM；

优选地，不同引物对对应的探针的3′端均标记淬灭基团BHQ1。

5.用于禽类病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1‑4任一项所述的核酸序列；

进一步地，所述检测试剂盒还包括样品处理液、阴性对照、阳性对照、反应扩增液、逆转录酶、无核酸水中的任一种或多种。

6.根据权利要求5所述的用于禽类病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述样品处理液包括裂解液和/或中和液；

优选的，所述裂解液的主要成分为：13～17mM EDTA、Triton X‑100 0.8～1.2v/v％、NP‑40 1.5～2.5v/v％、CHAPS 35～45g/L、2～3mM DTT、SDS 41～51g/L以及50～70mM NaCl；

优选的，所述中和液的主要成分为：甘油8～12v/v％、Triton X‑100 0.8～1.2v/v％、0.15～0.25mM PMSF、1.7～2.3mM DTT、pharmalyte 1.7～2.3v/v％以及100～120mM NaCl。

7.禽类病毒的检测方法，其特征在于，待检测病毒的核酸以权利要求1‑4任一项所述的核酸序列进行实时荧光定量PCR检测；

进一步地，所述待检测病毒的核酸通过以下步骤制备：

取待检测物，加入裂解液，振荡，然后加入中和液，混匀，离心，得到的上清液即为所述待检测病毒的核酸；

所述裂解液的主要成分为：13～17mM EDTA、Triton X‑100 0.8～1.2v/v％、NP‑40 1.5～2.5v/v％、CHAPS 35～45g/L、2～3mM DTT、SDS 41～51g/L以及50～70mM NaCl；

所述中和液的主要成分为：甘油8～12v/v％、Triton X‑100 0.8～1.2v/v％、0.15～0.25mM PMSF、1.7～2.3mM DTT、pharmalyte 1.7～2.3v/v％以及100～120mM NaCl。

8.根据权利要求7所述的禽类病毒的检测方法，其特征在于，所述裂解液与所述中和液的添加比例为1:1±0.1；

进一步地，所述待检测物包括禽类咽喉腔拭子采集物、泄殖腔拭子采集物、血液、血清、血浆、组织。

9.根据权利要求7或8所述的禽类病毒的检测方法，其特征在于，所述待检测物采用权利要求3‑4任一项所述的核酸序列同时实时荧光PCR检测；

进一步地，所述实时荧光定量PCR检测的反应条件：

第一步：42℃保持15‑20min；

第二步：94±1℃保持2‑5min；

第三步：94±1℃保持10‑15s，60℃保持28‑35s，40±2个循环，其中60℃设置采集荧光信号。

10.根据权利要求9所述的禽类病毒的检测方法，其特征在于，检测结果均采用以下方法判定：

阳性对照：CT值＜30并有明显的扩增曲线；

阴性对照：无CT值或者CT值>37，无明显扩增曲线；

待检测物CT值<30并有明显的扩增曲线，则判为阳性；

待检测物CT值>37并无扩增曲线，则判为阳性；

待检测物CT值介于30和37之间则判为可疑，需重复检测，若第二次检测CT值仍为30‑37并有明显扩增曲线则判定为阳性，否则为阴性。