[发明专利]鼻腔盥洗液外泌体的制备、鉴定方法

摘要

本发明公开了一种非诊断用途的鼻腔盥洗液外泌体的制备、鉴定方法，包括鼻腔盥洗液的采集、外泌体的提取与纯化、电镜鉴定外泌体、免疫印迹检测蛋白CD9、CD63的存在等步骤。本发明方法简单可行、方便有效，实现了鼻腔盥洗液中外泌体的提取；本发明方法准确可靠，克服了现有制备技术存在背景杂质干扰，外泌体回收率低、鉴定蛋白少等不足。而且，本发明方法能直接用于后续检测的优势，具有较高的科学研究等推广应用价值。

主权项

1.一种非诊断用途的鼻腔盥洗液外泌体的制备、鉴定方法，其特征是：包括下列步骤：（一）鼻腔盥洗液的采集分别采集健康志愿者和慢性鼻窦炎患者鼻腔盥洗液；具体操作过程如下：将5毫升生理盐水滴注在受试者的左鼻孔，嘱头部呈30°向后倾斜，软腭关闭，然后头部向前倾斜，收集鼻腔盥洗液；右鼻孔重复上述步骤；（二）外泌体的提取与纯化①将收集的鼻腔盥洗液通过滤网抽滤，初步过滤杂质及细菌；②将抽滤后的鼻腔盥洗液在4℃、3000g的离心条件下离心10分钟，分离去除鼻腔盥洗液中的细胞及其他杂质，然后得到上层液体；③将步骤②得到的上层液体移入第二离心管中，在4℃、6000g的离心条件下离心30分钟，进一步分离去除杂质，得到上层液体；④将步骤③得到的上层液体移入第三离心管中，在4℃、10000g的离心条件下离心1小时，得到上层液体；⑤将步骤④得到的上层液体移入超离管中，在4℃、10,0000g的离心条件下离心1小时，移除上层液体后，得到沉淀；⑥将步骤⑤得到的沉淀用PBS重悬洗涤后，通过分子排阻色谱法进一步纯化；⑦将步骤⑥处理后的鼻腔盥洗液移入超离管，在4℃、10,0000g的离心条件下再次离心1小时，得到沉淀于该离心管底部的鼻腔盥洗液的总外泌体；（三）电镜鉴定外泌体①将上述所得到的外泌体用PBS溶液重悬；②滴加20mL/L、pH6.8磷钨酸溶液，1:1混匀；③液取上述混匀液体 5ul滴于载样铜网上，室温下负染10分钟，白织灯下烤干；④透射电镜观察，发现：所得产物为50‑100nm大小的双分子层膜结构泡体；（四）免疫印迹检测蛋白CD9、CD63的存在①将提取纯化得到的外泌体用1ml的1×PBS重悬，得到外泌体重悬液，加入1ml裂解液，提取总蛋白；②BCA法测定外泌体蛋白含量；③制作10％及4％的梯度胶，加入足够的缓冲液，每孔上样50ug的外泌体总蛋白；④安装电极，接上电源，恒压80V，使蛋白质跑到同一条起跑线上，蛋白质跑至分离胶上时改为120V；⑤切胶，放入转膜缓冲液；将PVDF膜放置在甲醇中极化，蒸馏水中水化后放入转膜液，与棉垫及滤纸一起在转膜缓冲液中平衡15 min；⑥将PVDF膜、胶、棉垫及滤纸制作成“三明治”结构，第一层为棉垫，第二层为滤纸，第三层为胶，第四层为PVDF膜，第五层为滤纸，第六层为棉垫，夹紧；放入转膜槽内，加入转膜液和冰盒，转膜槽放在装满冰水的盆里；安装电极、接好电源，转膜条件设定为恒流200 mA，时间90 min；⑦转膜结束后，取出PVDF膜，进行标记，放在摇床上，TBST洗5 min × 3次，5 %脱脂牛奶封闭1‑2h；TBST洗膜5 min×3次；加一抗CD9、CD63孵育，室温1 h后4℃过夜；⑧TBST洗膜10 min × 3次；二抗孵育，室温2 h；TBST洗20 min × 3次；⑨暗室内显影，冲洗X感光胶片；经上述方法所得产物中检测到了外泌体表面特有的蛋白CD9、CD63的表达。