[发明专利]抗鸡产气荚膜梭菌感染的饲用益生菌筛选方法

摘要

本发明公开一种抗鸡产气荚膜梭菌感染的饲用益生菌筛选方法，该方法包括：临床产气荚膜梭菌感染发病鸡和抗病鸡的筛选及肠道食糜样本的采集；产气荚膜梭菌感染发病鸡和抗病鸡肠道微生物菌群的高通量测序；产气荚膜梭菌感染发病鸡和抗病鸡肠道微生物宏基因组学对比分析；抗产气荚膜梭菌感染的益生菌的筛选及鉴定。本发明通过对发病肉鸡和抗病肉鸡肠道菌群的宏基因组学大数据分析入手，有针对性地从抗病肉鸡肠道庞大的微生物菌群中筛选具有抗产气荚膜梭菌感染的益生菌，所筛选的益生菌来源于本体动物，避免了益生菌与宿主的不适应，且针对性强，避免了筛选的盲目性，节省了大量的人力、物力及时间。 1

主权项

1.一种抗鸡产气荚膜梭菌感染的饲用益生菌筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：在产气荚膜梭菌感染爆发的鸡场，通过临床症状的观察和病理损伤的检测，结合产气荚膜梭菌的定性PCR检测，挑选具有典型临床症状及明显病理损伤的发病鸡和无典型临床症状及明显病理损伤的抗病鸡各20‑30只，分别采集各个肉鸡的肠道内容物；

步骤2：利用16srRNA通用引物扩增各个肠道食糜中微生物的16srRNA基因，并对扩增片段进行检测和浓度测定，然后再利用标签引物进行第二次扩增，并对所扩增的片段进行浓度测得，将第二次扩增产物稀释至相同的浓度，等量混合，构建测序文库，进行测序；

步骤3：利用QIIME分析平台，对两组鸡肠道菌群进行分析，比较其α多样性和β多样性，对聚类的肠道微生物OTU进行物种注释，分析两组鸡肠道菌群物种分布；分析比较两组肉鸡肠道的差异菌群，核心菌群和优势菌群，并从只出现在抗病鸡肠道中的差异菌群中分析出其中的优势菌和核心菌,根据优势菌和核心菌的分析结果确定待筛选益生菌的目的菌株；

步骤4：将抗病鸡肠道菌群接种到肉汤中，厌氧培养，然后再用针对预筛选益生菌的选择培养基固体平板划线培养，根据步骤3确定的预筛选的益生菌的菌落特性，挑选阳性菌落，分别接种到液体选择培养基中增菌培养；

步骤5：对所筛选的益生菌进行生化特性鉴定和16s全基因测序鉴定，并从其中筛选出了两株益生菌。

2.如权利要求1所述的抗鸡产气荚膜梭菌感染的饲用益生菌筛选方法，其特征在于，所述步骤1中：

所述临床症状包括肉鸡饲料摄入量减少、体增重降低、营养吸收不良、腹泻、严重肠道坏死及死亡率增加、死性纤维素性肠炎。

3.如权利要求1或2所述的抗鸡产气荚膜梭菌感染的饲用益生菌筛选方法，其特征在于，所述病理损伤包括肠腔扩张充气，肠壁增厚，肠壁充血，有出血斑点，肠黏膜坏死，呈大小不等、形状各异的伪膜样坏死灶，肌肉苍白似放过血，肝脏和脾脏肿大，呈暗褐色。

4.如权利要求1所述的抗鸡产气荚膜梭菌感染的饲用益生菌筛选方法，其特征在于，

步骤1中采集的肠道内容物置放于‑80℃条件下保藏。

5.如权利要求1所述的抗鸡产气荚膜梭菌感染的饲用益生菌筛选方法，其特征在于，在步骤5后，还包括：

将所筛选的益菌接种至试验新生肉鸡体内，然后对试验肉鸡产气荚膜梭菌攻毒试验，观察并记录攻毒肉鸡发病情况计算发病率和死亡率，并测定试验肉鸡肠道组织形态结构及免疫细胞、免疫炎性因子和黏膜功能蛋白质水平，根据腹泻率、发病率和死亡率的统计结果、肠道组织形态结构及免疫细胞、免疫炎性因子和黏膜功能蛋白质水平，来分析所筛选的益生菌抗产气荚膜梭菌感染的效果。

6.如权利要求5所述的抗鸡产气荚膜梭菌感染的饲用益生菌筛选方法，其特征在于，所述步骤5还包括：

将购自没有进行产气荚膜梭菌免疫的鸡场的40只1日龄产气荚膜梭菌阴性肉鸡采用常规日粮饲喂，随机分为四组，四组分别为益生菌A组、益生菌B组、益生菌A+B组和对照组，每组10只肉鸡；

将所筛选的两组益生菌进行体外培养后，从1日龄早上开始对益生菌组肉鸡接种所筛选的益生菌，至7日龄；

第8日龄晚上每组肉鸡均口服灌注接种产气荚膜梭菌A型CVCC‑52进行攻毒，攻毒后持续观察48h，观察并记录攻毒肉鸡发病情况计算发病率和死亡率；

攻毒48h后，屠宰肉鸡采集肠道黏膜组织样品，测定肠道形态结构及免疫细胞，免疫及炎性因子和黏膜功能蛋白质水平来评判所筛选的益生菌抗鸡产气荚膜梭菌感染的效果。

7.如权利要求6所述的抗鸡产气荚膜梭菌感染的饲用益生菌筛选方法，其特征在于，在所述步骤5中，

试验肉鸡自1日龄至7日龄，首日接种剂量为5×10²cfu/100uL，然后每天依次为5×10³cfu/100uL、5×10⁴cfu/100uL、5×10⁵cfu/100uL、5×10⁶cfu/100uL和5×10⁷cfu/100uL。

8.如权利要求6所述的抗鸡产气荚膜梭菌感染的饲用益生菌筛选方法，其特征在于，试验肉鸡使用产气荚膜梭菌A型CVCC‑52进行攻毒的的攻毒剂量为10⁹cfu/100uL。

9.如权利要求6所述的抗鸡产气荚膜梭菌感染的饲用益生菌筛选方法，其特征在于，在步骤5中：

所述免疫及炎性因子包括白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素10、Ⅰ型干扰素、肿瘤坏死因子‑α和肠型脂肪酸结合蛋白。

10.如权利要求1所述的抗鸡产气荚膜梭菌感染的饲用益生菌筛选方法，其特征在于，两株益生菌为枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌。