[发明专利]一种液相芯片技术检测华法林和氯吡格雷基因多态性方法

摘要

本发明公开了一种液相芯片技术检测华法林和氯吡格雷基因多态性方法，其步骤包括：a、获取已知靶位基因标本；b、DNA提取；c、PCR引物设计；d、利用虾碱性磷酸酶/核酸外切酶I处理PCR扩增产物；e、设计高度特异性的ASPE引物；f、将ASPE产物与特异性荧光磁珠混合、杂交；g、在Luminex液体芯片平台一次检测6个变异位点情况；h、优化条件确定及验证；i、灵敏性验证试验；j、特异性验证试验；l、灵敏度、特异性、稳定性评估；k、以该技术检测需要抗凝患者300例，确定本地区不同位点与这些基因位点多态性的情况。该方法能有效检测华法林和氯吡格雷基因多态性，并能为临床提供及时、准确的用药信息。

主权项

1.一种液相芯片技术检测华法林和氯吡格雷基因多态性方法，其特征在于，包括有以下步骤，具体的：a、获取已知靶位基因标本30例：取30例标本的抗凝全血，并将获取的抗凝全血置于温度环境为4℃的冰箱中，置放时间不超过一个月；b、DNA提取：待30例标本的抗凝全血于冰箱中置放完毕后，通过DNA提取试剂盒进行DNA提取；c、根据SNP的rs号在Genbank中查找八个突变点附近碱基序列，遵循普通PCR引物设计原则，应用Primer6.0软件设计八对引物，引物设计前需经过BLAST搜索以排除同源区间，并保证引物间PCR扩增产物在100-600bp；将上述八对引物集中为1个多重 PCR 体系进行real-time PCR 扩增，查看标准曲线并检测扩增效率；如果部分位点扩增效率不够，则调整其 PCR 引物浓度或者设计，或者调整多重PCR的引物组合，直到优化到可以比较均衡扩增出所有位点，完成 PCR 优化；d、利用虾碱性磷酸酶/核酸外切酶I处理 PCR 扩增产物，降解 PCR 引物和 dNTP ，然后热灭活 Taq 酶；e、用PrimerPlex软件设计高度特异性的ASPE引物，突变点位于设计引物的3′端，通过ASPE反应让扩增产物偶联捕获序列引物并延伸；f、订购与这8对引物部分互补的核酸交联荧光磁珠，将ASPE产物与相应的特异性荧光磁珠混合、杂交；探针序列和生物素标记的ASPE反应产物完全互补；探针序列包括左右突变点，探针序列一般20bp，SNP或突变点位于探针序列中部，且SNP或突变点一般在8-14个碱基之间适当移动，探针的5′端加氨基修饰，探针的氨基端与杂交序列之间必须留有一定的空间，可在5′端氨基末端引入12个C做为修饰碱基，适当减少探针序列可增加杂交特异性，适当延长探针序列可增加杂交灵敏度；g、在Luminex 液体芯片平台一次可以检测这6个变异位点情况，在 Luminex200 系统上一次运行后分析结果；h、优化条件确定及验证：收集经过测序确定不同SNP位点各30例，采用优化好的技术进行验证，以确定该技术的可靠性；i、灵敏性验证试验：将已知突变点提取的DNA用PBS依次10倍梯度稀释，分别进行PCR扩增，然后取扩增产物应用液相芯片技术检测，每组试验3次，将3次都检出的浓度作为灵敏度；j、特异性验证试验：用所建立的方法分别检测上述6个突变点，分别做3次，评估检测系统的特异性；l、灵敏度、特异性、稳定性评估；k、以该技术检测需要抗凝患者300例，确定本地区不同位点与这些基因位点多态性的情况，为临床抗凝剂使用提供依据。