[发明专利]一种适用于谷子的简化基因组建库方法

摘要

本发明涉及一种适用于谷子的简化基因组建库方法，包括以下步骤，步骤一、利用限制性内切酶ApeKⅠ分别对若干谷子样品的基因组DNA进行酶切，得到酶切产物；步骤二、将条形码接头F和通用接头R与酶切产物进行连接，得到连接产物；步骤三：将若干谷子样品的连接产物等体积混合进行纯化，得到纯化后的连接产物；步骤四、取纯化后的连接产物，用通用引物F以及1种或多种条形码引物R进行PCR扩增，获得PCR产物；步骤五、对PCR产物进行纯化，获得目标片段，得到测序文库；步骤六、使用高通量测序平台对测序文库进行测序。本发明检测通量高，成本低，建库稳定性好，测序结果准确可靠，同时，还简化基因组测序和建库的步骤。 1

主权项

1.一种适用于谷子的简化基因组建库方法，其特征在于，包括以下步骤，

步骤一、利用限制性内切酶ApeK Ⅰ分别对若干谷子样品的基因组DNA进行酶切，得到酶切产物；

步骤二、将条形码接头F和通用接头R与酶切产物进行连接，得到连接产物，所述连接产物上包含有1处条形码序列；每个谷子品种所用接头F上的条形码序列互不相同；

步骤三、将若干谷子样品经步骤二制得的连接产物等体积混合进行纯化，得到纯化后的连接产物；

步骤四、对步骤三纯化后的连接产物，采用通用引物F以及1种或多种条形码引物R进行PCR扩增，获得PCR产物，所述PCR产物为若干谷子样品PCR产物的混合物；每个谷子样品的所得PCR产物上均具有2处条形码序列；

步骤五、对步骤四所得的PCR产物进行纯化，获得目标片段，得到测序文库；

步骤六、使用高通量测序平台对测序文库进行测序。

2.根据权利要求1所述的一种适用于谷子的简化基因组建库方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤一、利用限制性内切酶ApeK Ⅰ分别对若干谷子样品的基因组DNA进行酶切，得到酶切产物；

所用酶切体系为：NEB缓冲液2μL，5000U/ml的Apek Ⅰ0.5μL，谷子基因组DNA 500ng，加水至最终体系20μL，放于PCR仪中，反应程序为75℃，2h；

步骤二、将条形码接头F和通用接头R与酶切产物进行连接，得到连接产物，所述连接产物上包含有1处条形码序列；

所用连接体系：10xT4 DNA连接酶反应缓冲液5μL，350U/μL的T4 DNA连接酶2μL，接头F 5μL，接头R 5μL，加水至30μL，与步骤一酶切反应完成后的体系溶液混合，放置于PCR仪中，反应程序为22℃60min，65℃30min；

步骤三、将若干谷子样品经步骤二制得的连接产物等体积混合进行纯化，得到纯化后的连接产物；

步骤3‑1、将若干谷子样品的经步骤二制得的连接产物等体积混合，按混合后的体系溶液与磁珠体积比1:1.5，在混合后的体系溶液中加入的磁珠，悬浮混匀，静置2min后将样品放于磁力架上，至溶液澄清，抛弃上清液，留磁珠；

步骤3‑2、加入100μL体积浓度为80％乙醇，悬浮磁珠以便洗涤；

步骤3‑3、用磁力架吸附磁珠，至溶液澄清；

步骤3‑4、去除上清液，室温放置，至乙醇挥发干净；

步骤3‑5、加入20μL DNA洗脱液，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA；

步骤3‑6、用磁力架吸附磁珠后，将上清液转移至新管中，即得纯化后的连接产物溶液；

步骤四、取步骤三纯化后的连接产物，采用通用引物F和条形码引物R进行PCR扩增，获得PCR产物，所述PCR产物为若干谷子样品PCR产物的混合物；每个谷子样品的所得PCR产物上均具有2处条形码序列；

所用扩增体系：纯化后的连接产物溶液10μL，HiFi酶25μL，引物F 1μL，1种引物R或多种引物R的混合物1μL，加水至50μL；

所述PCR反应程序为：72℃5min；98℃30s；98℃10s，65℃30s，72℃30s，15个循环；72℃5min；

步骤五、对步骤四所得的PCR产物进行纯化，获得目标片段，得到测序文库；

步骤5‑1、PCR扩增完成后，按PCR扩增体系的溶液与磁珠体积比1:0.6，在步骤四PCR反应完成后的体系溶液中加入磁珠，悬浮混匀，静置2min后移至磁力架上，至溶液澄清，然后吸取上清液至新的管中，得新的上清液；

步骤5‑2、按PCR扩增体系的溶液与磁珠体积比1:0.8，向步骤5‑1所得新的上清液中加入磁珠，充分混匀，室温静置2min，用磁力架吸附磁珠，至溶液为澄清，吸取上清液，抛弃上清液，留磁珠；

步骤5‑3、加入100μL体积浓度为80％新鲜配制的乙醇，悬浮磁珠以便洗涤，然后用磁力架吸附磁珠，至溶液澄清，去除上清液，室温放置，至乙醇挥发干净；

步骤5‑4、加入20μL DNA洗脱液，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA，用磁力架吸附磁珠后，将所得上清液转移至新管中，即可；

步骤六、使用高通量测序平台对测序文库进行测序。

3.根据权利要求2所述的一种适用于谷子的简化基因组建库方法，其特征在于，步骤三和步骤五中所述磁珠为AMPure XP Beads。

4.根据权利要求2所述的一种适用于谷子的简化基因组建库方法，其特征在于，所述接头F的序列为：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGXXXXXX；所述XXXXXX为条形码序列；

所述接头R的序列为：GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC；

所述引物F的序列为：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCG；

所述引物R的序列为：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATYYYYYYGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC；

所述YYYYYY为条形码序列。

5.根据权利要求4所述的一种适用于谷子的简化基因组建库方法，其特征在于，

所述接头F上的XXXXXX序列选自ATCACG、CGATGT、TTAGGC、TGACCA、ACAGTG、GCCAAT、CAGATC、ACTTGA、GATCAG、TAGCTT、GGCTAC、CTTGTA、AGTCAA、AGTTCC、ATGTCA、CCGTCC、GTAGAG、GTCCGC、GTGAAA、GTGGCC、GTTTCG、CGTACG、GAGTGG、GGTAGC、ACTGAT、ATGAGC、ATTCCT、CAAAAG、CAACTA、CACCGG、CACGAT、CACTCA、CAGGCG、CATGGC、CATTTT、CCAACA、CGGAAT、CTAGCT、CTATAC、CTCAGA、GACGAC、TAATCG、TACAGC、TATAAT、TCATTC、TCCCGA、TCGAAG、TCGGCA、GCTAGC、TAGTGT、GTCGAT、AGTGAG、CTACAT、GCGTCT、GTATCT、CGAGTC、GACTCG、TGCATC、GTACGT、ATATGA、GACTGA、ATCGAC、AGCAGT、GATGTA、TCAGAG、ACAGCT、CGTGAC、TCACGT、GCATGT、GCTCTC、CGCATA、CGACAG、ACACGA、CACTAC、GAGACG、ACGCAG中的任意一个；

步骤四所述引物R上的YYYYYY序列选自GTGCAT、ATGAGC、GGTAGC、GTAGAG中的任意一个。

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