[发明专利]应用于组织样本中核小体位点MNase酶切优化方法

摘要

本发明涉及应用于组织样本中核小体位点MNase酶切优化方法，包括制备染色质、制备DNA，MNase酶切，回收DNA片段，高通量测序，效率检验。本发明对组织细胞核的前期收集方法进行改进，并优化酶切反应条件，提高了酶切效率和回收率。不仅能够有效的获取正确的染色质片段，而且能够在精准定位转录调控元件在全基因组上的结合位点，提高了临床样本的研究进程。

主权项

1.应用于组织样本中核小体位点MNase酶切优化方法，其特征在于，该方法包括以下处理步骤：步骤一：制备染色质：将收集的组织样本用预冷至0℃的生理盐水洗涤后加入到红细胞裂解液中去除红细胞，用无菌蒸馏水洗涤后得到白细胞，所述红细胞裂解液包括：30mM KHCO3、250mM NH4Cl、10mM EDTA-Na2；将以下操作重复2次，操作为：加入TEDP溶液，置于37℃水浴中高速离心；所述TEDP溶液包括：50mM Tris-HCl、2mM EDTA、2mM DDT、10wt％甘油、50μg/mL PMSF；加入所述TEDP溶液后平铺于300mM的蔗糖溶液上，匀浆70000g中离心1h，洗涤后加入到染色质贮存液中，所述染色质贮存液包括：10mM Tris-HCl、5mM PMSF；步骤二：制备DNA：首先，将步骤一的产物加入到裂解缓冲液中，所述裂解缓冲液包括：10mM Tris-HCl、5mM EDTA、500mM NaCl、1wt％SDS；加入RNase使终浓度为100μg/mL，37℃水浴0.5h；加入蛋白酶K使终浓度为100μg/mL，55℃水浴2h；重复以下操作3次，操作为：加入等体积的氯仿醇溶液，温和混匀后静置10min，取上层清液；所述氯仿醇溶液包括：Tris饱和酚、氯仿、异戊醇，体积比为25:24:1；加入两倍体积的无水乙醇沉淀后得到DNA样品；步骤三：MNase酶切：首先，在所述DNA样品中加入微球菌核酸酶和酶切缓冲液，37℃水浴中酶切10min后，加入等体积的酶切终止液；所述酶切缓冲液包括：15mM Tris-HCl、15mMNaCl、50mM KCl、2mMEDTA、1mM EGTA；所述酶切终止液包括：20mM NaCl、20mM EDTA、1wt％SDS、1wt％甘油；加入蛋白酶K，55℃孵育1小时后，加入等体积的所述氯仿醇溶液，温和混匀后静置10min，取上层清液；加入两倍体积的所述无水乙醇，在-20℃沉淀10h后，在4℃下匀浆70000g中离心15min，室温晾干后加入TE缓冲液；所述TE缓冲液包括：10mM Tris-HCl、2mM EDTA；步骤四：回收DNA片段：将步骤三的产物放置在1.3wt％的琼脂糖胶中，80V，1小时电泳，切胶回收融化凝胶中的DNA；步骤五：高通量测序：首先将步骤四回收的DNA进行高通量测序得到MNase数据；然后将所述MNase数据进行接头过滤后再进行读段定位，将得到的读段回填到参考基因组上得到读段回填结果；步骤六：效率检验：首先，将所述MNase数据中基因组序列从第一个碱基对开始依次划分为多个长度为100bp的非重叠的连续的检验序列，并按照划分的次序对所述检验序列编号，检验序列的编号是由1开始的连续的正整数序列；然后，统计每个所述检验序列内的读段数量；最后，用公式一计算回收效率：公式一：其中，ε是所述回收效率，为0～1之间的实数；i是所述检验序列的编号，为正整数；n是检验序列的个数，为正整数；x是所述检验序列内的读段数量，xi是编号为i的检验序列内的读段数量，所述x和所述xi为正整数。