[发明专利]一种印染废水中成组生物毒性监测及鉴别评估方法

摘要

本发明公开了一种主要以印染废水为研究对象的成组生物毒性监测试验及鉴别评估方法，属于生物毒性识别领域。其步骤为：筛选发光菌、斑马鱼幼鱼、斑马鱼胚胎及小球藻作为供试生物，并采用成组生物毒性试验，结合毒性评价方法对印染废水进行风险及毒性削减评估，并根据废水污染特征及结果，结合TIE技术构建毒性鉴别评估体系。本发明涵盖了分解者、生产者、消费者3个营养级的成组生物毒性试验来表征印染废水的毒性，解决了单一生物毒性测试不具有代表性的问题，具有全面、简单、高效、从源头控制、安全性高等优点，可广泛应用于研究和评价有毒污染物对生态环境的影响，为生态风险评价评价提供一定的依据。

主权项

一种印染废水中成组生物毒性监测及鉴别评估方法，其特征在于具有如下实施步骤：(1)选择受试生物：筛选明亮发光杆菌T₃小种，实验室制作的发光细菌冻干粉，初始发光强度高于200万光子数的发光菌、运用实验室长期稳定培养的达到性成熟斑马鱼，按照雌雄比1:2的比例置于孵化盒中，并在黑暗条件下形成受精卵的斑马鱼幼鱼以及斑马鱼胚胎、BG11(见表1‑1)液体培养基培养的小球藻作为试验对象，并建立成组生物毒性试验。表1‑1BG11培养基成分Table 1‑1 Composition of BG 11 medium注：上述试剂均为分析纯(2)菌悬液的配制将4℃保存下的明亮发光杆菌冻干粉，于4℃保存的1mL 2.5％NaCl溶液中复苏3min，菌体即发光，加入于4℃保存下的9mL 3％NaCl溶液到，混匀后20℃恒温振荡20min，用3％NaCl制成所需浓度的菌悬液，使用微孔板多功能检测仪测定初始发光强度。(3)确定最大吸收峰及小球藻初始接种浓度参考一些研究，得到藻液的最大吸收波长为685nm，确定了藻液的初始接种吸光度应在0.06～0.07之间最为合适。(4)对受试体生物进行染毒处理发光菌染毒：将细胞板每一排微孔的前5个孔，各孔总体积200μL，其中菌液和试样各100μL，加入菌液15min后，然后使用微孔板型多功能检测仪测定受试样品中发光菌的发光强度。斑马鱼幼鱼染毒：染毒试验用鱼为孵化后1小时的正常斑马鱼幼鱼。向每个培养皿中加入15mL待测溶液后，在加入10条幼鱼。每隔24h观察和记录斑马鱼幼鱼的死亡情况，并及时清除死亡的幼鱼及其代谢物。斑马鱼胚胎染毒：选用24孔细胞培养板进行试验，每个培养板的第一列4个孔加入2mL标准稀释水作为组内空白对照，其余20个孔加入2mL待测液，然后分别放入2枚正常发育的斑马鱼胚胎，置于28±0.5℃的培养箱中。小球藻染毒：根据取生长至对数期的藻液，用贮备的无菌培养基将其稀释至吸光度在0.06‑0.07之间，即为藻测试液。取50mL藻测试液及不同浓度待测废水混合于锥形瓶中暴露120h，在每天光照期间进行摇瓶2‑3次。(5)废水毒性表征发光菌：通过15min相对发光抑制率、EC₅₀及TU来表征废水毒性。斑马鱼幼鱼：以96h致死率、96h LC₅₀及TU来表征废水毒性。斑马鱼胚胎：废水毒性以72h‑ELC₅₀、72h‑HEC₅₀、MEC₅₀和TU来表征，ELC₅₀、HEC₅₀和MEC₅₀分别表示使斑马鱼胚胎死亡率、孵化率及畸形率达到50％时所对应的废水浓度。小球藻：在染毒后0h、24h、48h、72h、96h及120h时，用紫外分光光度计测定不同处理组及空白对照组的藻液吸光度，根据公式计算每24h的小球藻生长抑制率，最后废水毒性以每个时间段小球藻生长抑制率、IC₅₀及TU表示。式中，A_tn―处理组第n h测定的含藻液试样的吸光度；A_t0―处理组0h测定的含去离子水的藻液吸光度；A_cn―对照组第n h测定的含藻液试样藻液吸光度；A_c0―对照组0h测定的去离子水的藻液吸光度。(6)毒性单位计算$TU=\frac{100\%}{{\mathrm{LC}}_{50}({\mathrm{EC}}_{50},{\mathrm{IC}}_{50})}$TU＝RE×0.02×100RE是经受试废水染毒后，发光菌相对抑制发光强度、斑马鱼幼鱼和胚胎的死亡率及小球藻的生长抑制率(％)。(7)印染废水的毒性鉴别评估建立发光菌、斑马鱼胚胎、斑马鱼幼鱼及小球藻4种生物毒性试验的基础上，比较了采用毒性单位及AvTx、TxPr、MST及PEEP四种综合评价指标来评价印染废水毒性大小的评价方法。