[发明专利]一种西番莲花叶病毒病早期检测方法

摘要

本发明公开了一种西番莲花叶病毒病早期检测方法，通过设计西番莲花叶病毒外壳蛋白基因片段的特异性引物，应用RT‑PCR技术扩增目的基因片段，从而实现对病毒的准确检测。RT‑PCR技术的样品需求量少、技术难度小、准确性高、适用于大规模样品分析。该技术不仅能诊断疑似西番莲花叶病毒侵染症状的样品，还能鉴定病毒处于潜伏阶段而未表现出明显症状的样品，能实现感病植物的早期诊断。

主权项

1.一种西番莲花叶病毒病早期检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、花叶病毒侵染的西番莲总RNA的提取S11、取西番莲花叶病毒侵染叶片100mg，液氮研磨后转移至2ml离心管内，加入Trizol试剂1ml，充分混匀后，室温放置5min，以便样本被Trizol试剂充分裂解，得裂解液；S12、按每1ml裂解液添加200μl氯仿的比例在所得的裂解液中加入氯仿，盖严管盖，上下剧烈摇晃15s后，室温放置3min，在4℃下12000rpm离心15min；S13、离心后，管中液体分层，转移最上层的无色液体至一个新的无RNA酶的1.5ml离心管中，然后加入100％异丙醇500μl，室温放置10min后，在4℃下12000rpm离心10min；S14、离心完成后，小心吸去上清，加入75％的乙醇1ml，上下颠倒8次，7500rpm，4℃离心5min，除去乙醇，开盖后室温放置5～10min，20μl DEPC处理的灭菌水溶解RNA，备用；S2、cDNA第一链的合成S21、在无RNA酶的PCR管中加入总RNA1μg和浓度为100μM的序列为AGATGTGGGAATGCGT的基因特异性引物1μl，并用DEPC处理过的灭菌水补充至体积12μl，得混合液；S22、将上述混合液于65℃处理5min后，在冰上立即冷却1min，然后向混合液中依次加入5X reaction buffer 4μl、浓度为20U/μl的RiboLock RNase Inhibitor 1μl、10mM dNTP mix 2μl、200U/μl的RevertAid M‑MuLV Reverse Transcriptase 1μl，将其轻轻混匀，短暂离心后，置于PCR仪内42℃孵育1h；然后70℃孵育5min，结束反应，即得cDNA第一链；S3、西番莲花叶病毒RT‑PCR检测S31、引物的设计采用Primer Premier 5.0软件进行特异引物设计：上游引物PafMVF：5′‑CCGCTCCGCTTCCTCCTC‑3′；下游引物PafMVR：5′‑TTGAATACACGAGCACGGCG‑3′；S32、在以下PCR反应体系中进行PCR反应：PCR‑Grade Water 15.0μl；2X Ex taq Buffer 25.0μl；10mM的dNTP Mix 1.0μl；5U/μl的Ex taq酶1.0μl；cDNA第一链5.0μl；10μM的PafMVF1.5μl；10μM的PafMVR1.5μl；S4、将所得的PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳处理，电压120V，电泳0.5h，得含有PCR片段的凝胶；S5、用刀片切取含有PCR片段的凝胶，放置于1.5ml离心管，称重；加入3倍体积凝胶重量(mg)的GSB溶液，60℃金属浴10min；待凝胶完全溶解后，加入1/3体积GSB溶液的预冷异丙醇；溶液冷至室温后，用移液枪吸取至离心柱，静置1min，10000rpm离心1min；倒掉收集管中的废液，加入WB溶液650μl，室温下，10000rpm离心1min，弃流出液；再次离心，彻底去除残留溶液；将离心柱转移至1.5ml离心管，开盖静置1min；在离心柱中间滴加灭菌dd H2O 30μl，静置1min；10000rpm离心1min，洗脱PCR片段；回收片段连入TA克隆载体pGM‑T载体，16℃孵育12h，得连接产物；S6、取5μl连接产物导入大肠杆菌DH5a感受态细胞，于含50mg/l氨苄霉素的LB固体培养基上筛选，37℃培养12h，挑取白色单菌落，以M13引物，PCR验证其阳性；阳性单克隆于含50mg/l氨苄霉素的LB液体培养基，37℃培养12h后用于质粒提取，然后使用通用引物T7和SP6进行序列测定。