[发明专利]一种草鱼下丘脑细胞体外培养方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，具体公开了一种草鱼下丘脑细胞体外培养方法，本发明草鱼原代下丘脑细胞的纯化和培养方法，能够获得数量多、纯度高的原代下丘脑细胞，并且通过我们申请人配制的NM培养液能够明显提高所获得草鱼下丘脑细胞活力状况，该原代细胞培养方法可以为深入研究鱼类神经内分泌系统打下坚实基础。

主权项

一种草鱼下丘脑细胞体外培养方法，包括下述步骤：（1）将清洗干净的健康的新鲜草鱼下丘脑切成直径为0.5‑1.0 mm的碎片；（2）将切好的下丘脑碎片收集到离心管中，加入WM培养基清洗；（3）将清洗好的下丘脑碎片转移到一个新的离心管中，加入含有3‑8mg/ml trypsin 的WM培养基，20‑37°C水浴中消解；（4）将含有Trypsin的WM培养基吸去，然后加入含有2‑5 mg/ml Trypsin inhibitor的WM培养基；（5）将含有trypsin inhibitor的WM培养基吸去，加入含有0.1‑0.5mg/ml DNase II的WM培养基，室温静置以消解细胞间的DNA连接；（6）吸去含有DNase II的WM培养基，加入含有1.5~3.0mM EDTA的BM培养基摇晃或是静置后将培养基吸走；（7）将下丘脑碎片转移到新的离心管中，向管中加入BM培养基，使用吸管轻轻吹打下丘脑碎片，细胞被吹散，此时将上层细胞使用40‑100 μm孔径的细胞筛过滤后收集到离心管中；（8）将过滤出的细胞转移至新的离心管中，1000‑3000 rpm离心10‑30 min收集细胞；（9）将上层培养基去除，加入PM培养基重悬细胞；（10）取细胞悬浮液，加入台酚蓝染色后，显微镜下计数；（11）加入PM培养基将下丘脑细胞稀释，将细胞接种到细胞培养板中，每孔接种0.5‑3.0 ×106 cells，加入含有FBS的PM培养基，使得每孔中FBS的终含量为5‑10%；；（12）下丘脑细胞在含有5‑10 %FBS的PM培养基中培养贴壁后，将培养基吸去，加入：含有5‑15 ng/ml碱性成纤维生长因子的NM培养基进行传代培养；或加入NM培养基培养后进行后续加药实验；所述的WM培养基的配方包括:MEM: 10.0‑12.0 mg/ml, HEPES: 6.0‑8.0 mg/ml, NaHCO3: 2.0‑3.0 mg/ml, BSA: 3.0‑5.0 mg/ml, 青霉素: 50‑100 U/ml，链霉素：50‑100 μg/ml;所述的BM培养基的配方包括:S‑MEM: 10.0‑12.0 mg/ml, HEPES: 6.0‑8.0 mg/ml, NaHCO3: 2.0‑3.0 mg/ml，BSA: 3.0‑5.0 mg/ml，青霉素: 50‑100U/ml，链霉素：50‑100 μg/ml，所述的S‑MEM为Ca2+freeMEM；所述的 PM培养基的配方包括:MEM: 10.0‑12.0 mg/ml, NaHCO3: 2.0‑3.0 mg/ml, HEPES: 6.0‑8.0 mg/ml, 青霉素: 100‑200 U/ml，链霉素：100‑200μg/ml;所述的NM培养基的配方包括MEM:10.0‑12.0 mg/ml, NaHCO3:2.0‑3.0 mg/ml, HEPES: 6.0‑8.0mg/ml, 青霉素: 100‑200 U/ml，链霉素：100‑200 μg/ml，GlutaMax Supplement: 25‑50μM，B27 Supplement (50×): 2‑5%，FBS: 5‑10%。