[发明专利]一种布瓦西坦中间体的制备方法

摘要

本发明公开了一种布瓦西坦中间体的制备方法，以4‑正丙基‑2(5H)‑呋喃酮为底物，在重组烯还原酶和辅酶及辅酶再生系统的作用下，在温度为25℃‑30℃且pH值为6.0‑9.0的水相缓冲液中反应生成中间体(R)‑4‑正丙基二氢呋喃‑2‑酮。本发明通过采用特定的烯还原酶，解决了现有布瓦西坦中间体(R)‑4‑正丙基二氢呋喃‑2‑酮合成路线长、收率低、成本高和采用有毒危险试剂造成环保压力大的问题，具有重要的工业应用价值。

主权项

一种布瓦西坦中间体的制备方法，以4‑正丙基‑2(5H)‑呋喃酮为底物，在烯还原酶和辅酶及辅酶再生系统的作用下进行反应，具体包括：步骤1：重组烯还原酶的制备：将已双酶切的表达载体pET‑30a与合成的目的基因用T4连接酶进行连接过夜，将10uL的连接产物加入100uL的Rosetta(DE3)感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激60sec，冰上放置2min，加入预热的0.45mL LB培养基220rpm 37℃培养1h，将200uL菌液加入含有100μg/mL的卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养12‑16，得到重组菌E.coli Rosseta；将含有烯还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基活化过夜；进行振荡培养OD600值达到0.6‑0.8，再加入诱导剂继续培养过夜；离心收集细胞，用磷酸缓冲液悬浮细胞，将细胞悬浮液置于冰浴中，利用超声波破碎，最后进行离心处理；步骤2：将所述步骤1获得的重组烯还原酶、辅酶、辅酶再生系统和底物4‑正丙基‑2(5H)‑呋喃酮加入到PH值为6.0‑9.0的水相缓冲液中进行反应；步骤3：待反应终止后，用硅藻土过滤掉溶液中的杂质，用乙酸乙酯对滤液进行萃取，用无水硫酸钠进行干燥，最后减压蒸馏，重结晶得到布瓦西坦中间体(R)‑4‑正丙基二氢呋喃‑2‑酮。