[发明专利]一种甾体羟化酶基因的高效筛选方法

摘要

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种甾体羟化酶的高效筛选方法。本发明针对雷斯青霉的生长特性和产酶特性，获得了雷斯青霉专用的高效产孢培养基，然后通过筛选合适的助溶剂和建立最佳诱导条件进一步强化了诱导过程对目标基因转录表达的良性驱动，同时引入转录组测序和qRT‑PCR组合的方法借助计算机分析生物信息学信息形成了高效筛选具备C15α位羟化酶功能编码基因的识别方法，获得来源于雷斯青霉的C15α位羟化酶编码基因，在原始基因序列的基础上通过进一步筛选获得编码高活性C15α位羟化酶的新基因。

主权项

一种甾体羟化酶基因的高效筛选方法，其特征在于，具体如下：(1)采用高效产孢培养基培养雷斯青霉所述高效产孢培养基是在雷斯青霉常用培养基的基础上添加以下固型粉料中的至少一种形成：玉米秸秆粉碎物，小麦秸秆粉碎物，高粱秸秆粉碎物，水稻秸秆粉碎物，玉米芯粉碎物，豆粕粉碎物，木屑粉碎物，麸皮粉碎物，鱼粉粉碎物，贝壳粉碎物；(2)雷斯青霉菌丝体培养制备孢子悬液并接种到培养基中，进行菌丝体培养；(3)诱导转化诱导组菌丝体培养24h后添加0.01‑0.02％的底物进行诱导3.5～7.0h，之后再投加0.1％的底物进行甾体转化，并以不进行诱导的转化过程做对照组；(4)雷斯青霉总RNA的提取、纯化和cDNA的合成转化完成后，分别提取诱导组和对照组雷斯青霉的总RNA；去除基因组DNA后进行转录组测序和cDNA的合成；(5)qRT‑PCR分析筛选目的基因①转录组测序后挑选开放阅读框完整的基因作为候选基因，将候选基因与已报到的P450酶家族基因进行比对，获得目标基因；②根据筛选出的目标基因设计qRT‑PCR引物，选择内参基因做对照，通过qRT‑PCR计算目标基因诱导组与对照组的表达差异倍数，确定最终的目的基因；③以cDNA为模板，扩增获得目的基因的完整核苷酸序列，并通过筛选获得高活性羟化酶基因。