[发明专利]一种果蔗脱毒组培快繁的方法

摘要

本发明公开了一种果蔗脱毒组培快繁的方法。本发明的方法包括1）外植体的选择；2）高温减毒处理；3）茎尖脱毒接种和无菌苗获得；4）病原体检测；5）继代增殖；6）生根与炼苗；7）假植移栽及管理。本发明将温水处理和人工气候箱高温催芽有效结合，对蔗芽进行减毒处理，脱毒率高；选取3‑5mm的茎尖启动接种培养，成活率高达90%以上；启动培养过程，通过更换启动培养基、在培养基中添加PVP的方式，有效避免褐化，提高无菌株系获得率；在生根培养基添加MET成分，使生根过程出根快、根多、整齐；组培快繁过程的培养基均使用较低浓度的激素，最大程度地减少激素对组培苗的影响，保持品种原有种性，增殖系数为2‑4倍，达到提纯复壮、快速繁育的目的。

主权项

一种果蔗脱毒组培快繁的方法，其特征在于：包括如下步骤：1）外植体的选择：选取品种纯正、长势健壮、无病害、蔗芽饱满植株，取中间蔗芽成熟而饱满的果蔗蔗茎将其砍成单芽段，用自来水洗净备用；2）高温减毒处理：将步骤1）处理后的单芽段放入50℃恒温水箱中进行温热处理2h，捞起晾干，再将其种于预先经压力为1.1‑1.2kg/cm2的高压蒸汽灭菌锅在121℃消毒30min的基质中，淋透水，然后置于38‑40℃的人工气候箱中连续进行高温恒温催芽8‑12天，期间喷水，保持基质湿润，每天换气2‑3次，每次1‑2min；待蔗芽长到6‑10cm高时，取出作为下一步组培接种外植体；所述基质为椰糠与泥炭土按1︰1体积比均匀混合得到；3）茎尖脱毒接种和无菌苗获得：将步骤2）处理得到的6‑10cm高的蔗芽从基部小心切下，去掉外面1‑2层叶片和叶鞘，置于超净工作台上，用75%酒精消毒过的接种刀切除多余的叶片，保留5cm大小，放入0.1%氯化汞溶液中浸泡8‑12min进行消毒，然后倒掉氯化汞消毒液，加入等量无菌水浸洗3‑4次，浸洗时要时不时进行摇晃或搅拌，每次浸洗时间为4‑5min，最后一次浸洗完后将水倒出，用消毒过的镊子将蔗芽夹出放在消过毒的接种碟上，在超净工作台上慢慢晾干水分，然后用消过毒的镊子和接种刀小心将蔗芽叶片一层层剥离，直到露出3‑5mm的茎尖生长点，用锋利的消过毒的接种刀将茎尖切下接种到启动培养基中，于25℃自然散射光下培养，培养期间，前2‑3次每5‑7天更换一次新鲜的培养基，之后每10‑15天更换一次新鲜的培养基，40‑45天后形成丛生芽；4）病原体检测：取步骤3）获得的丛生芽叶片，采用PCR或RT‑PCR技术进行病原菌检测，确定不带宿根矮化病和花叶病后，再将无病菌病毒的丛生芽作为原种进行进一步的继代增殖；5）继代增殖：将步骤4）检测后确定无病菌病毒的丛生芽在无菌条件下自然分成单株或多株，转接于分化培养基，在温度26±2℃、相对湿度40%‑70%、光照度1000~1500lx、光照时间10~12h/天条件下继代培养，15‑20天继代1次，继代次数控制在10代以内，增殖系数为2‑4；6）生根与炼苗：将步骤5）继代增殖所获得的5‑10cm高的小苗在无菌条件下切除过长叶片，接种到生根培养基中，置于温度25±3℃、相对湿度40%‑70%、自然光照条件下的炼苗棚或炼苗室内边促根边炼苗；培育6‑10天开始出根，15‑20天长出完整根系，获得生根组培苗；7）假植移栽及管理：将步骤6）获得的生根组培苗从培养瓶或培养袋中取出，洗掉培养基，减去1/3~1/2的多余叶片，用0.2%多菌灵消毒后，自然分成3~5株为一丛，按照5cm×5cm株行距移栽到苗床上，淋足定根水，搭小拱棚用薄膜覆盖，外加遮阳网遮盖避免强光暴晒；假植5天后，新根系开始长出，叶片稍展开即喷施0.1%尿素和0.1%磷酸二氢钾混合溶液以促进小苗生长，其后每周施一次水肥，并注意适当剪叶和病虫害防治；待小苗返青后，逐渐揭去遮阳网和薄膜，使小苗进一步适应外界环境；20~30天后当密植苗长到5片真叶时，分单株进行上袋假植，其水肥管理同丛苗密植圃假植；经2‑3个月上袋假植，假茎高15‑20 cm时出圃到一级圃进行扩繁。