[发明专利]检测电子烟气溶胶水提物对细胞脂质过氧化影响的方法

摘要

本发明公开了一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞脂质过氧化影响的方法。包括样品前处理、单细胞悬浮液制备、细胞浓度计算、细胞接种、受试物暴露、收集细胞、细胞裂解、标准品配制、吸光度测定和丙二醛含量计算等步骤。本发明综合考察了电子烟制品的暴露途径，作用方式，建立了全新的电子烟制品烟雾前处理方法，选取人肺成纤维细胞HPF作为检测用细胞，并确定了样品检测剂量。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确检测电子烟制品对细胞脂质过氧化的影响，进而能够有效地评价电子烟制品对细胞氧化性损伤的影响。

主权项

一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞脂质过氧化影响的方法，具体为以下步骤：(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，‑80℃保存待用；(2)单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm2细胞培养瓶中，加入10mLFM细胞培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；(4)细胞接种：将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，接种到100mm细胞培养皿中，每皿6ml，然后将细胞培养皿置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h；(5)受试物暴露：取出细胞培养皿，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液加入细胞培养皿中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；表1细胞脂质过氧化检测加样表(6)收集细胞：移除细胞培养皿中的培养基，细胞用PBS磷酸盐缓冲液洗一遍，加入质量浓度0.25％的胰蛋白酶溶液；每孔中的细胞用HPF细胞培养基悬起，分别收集到15ml离心管中，1000rpm，4℃条件下离心10min，去上清；(7)细胞裂解：每支离心管中加入100μL细胞裂解液，0℃冰浴1min，1600rpm，4℃条件下离心10min，取上清液待测；(8)标准品的配制：取丙二醛标准品用蒸馏水分别稀释至1、2、5、10、20、50μM，得到不同浓度梯度的标准品稀释液；(9)吸光度测定：在不同的离心管内分别加入0.1ml待测上清液和不同浓度梯度的标准品稀释液，再分别加入0.2ml浓度为0.185mg/ml的硫代巴比妥酸MDA检测工作液混匀，100℃沸水浴15min，1000rpm室温离心10min；取200μL上清液加入96孔板中，酶标仪532nm测定吸光度；(10)丙二醛含量计算：根据标准溶液吸光度值绘制标准曲线，计算样品中的丙二醛含量。