[发明专利]利用海洋解淀粉芽孢杆菌制备酰胺类及酯类化合物的方法与用途

摘要

一种利用海洋解淀粉芽孢杆菌BMF01菌株发酵制备13‑碳二十二烯酰胺的方法，其步骤包括BMF01菌株的发酵及其发酵液的制备、BMF01菌株发酵液的酸沉淀及甲醇提取、BMF01菌株发酵液甲醇抽提物的硅胶柱层析、Sephadex LH‑20柱层析，得到MD‑4组分在11.5 min时出现吸收峰，经结构鉴定该化合物为13‑碳二十二烯酰胺。本发明还涉及海洋解淀粉芽孢杆菌BMF01中制备酯类化合物的方法。本发明方法制得的13‑碳二十二烯酰胺、酯类化合物具有抑制小麦根腐病菌的用途。本发明首次以BMF01菌株为基础制得5种具有抑菌用途的化合物，其方法简单，可操作性强。

主权项

一种利用海洋解淀粉芽孢杆菌（Ｂacillus amyloliquefaciens）BMF01菌株发酵制备13‑碳二十二烯酰胺的方法，其特征在于，其步骤如下：（1）BMF01菌株的发酵及其发酵液的制备将活化培养24h的BMF01菌株斜面用5 mL种子液培养基洗下菌苔制成BMF01菌株菌悬液，接种到装有55ml种子液培养基的250ml三角瓶中，28 ℃下，摇床转速180 r/min，振荡培养24 h，调整浓度为108 cfu/mL，即得发酵用种子液；按接种量10%将种子液接入装有27 L发酵培养基的50 L自动发酵罐中进行发酵，根据溶氧需求调整气阀使罐压维持0.04 Mpa，通气量为3 L/min，28 ℃，180 r/min发酵60 h，4℃、12000r/min条件下离心20min去掉菌体，得到发酵液；所述的种子液培养基和发酵培养基为：蔗糖10 g/L，牛肉膏16 g/L，酵母膏3 g/L，FeSO4 0.4 g/L，水1000 mL，pH 7.0；（2）BMF01菌株发酵液的酸沉淀及甲醇提取用6 mol/L HCl将BMF01菌株发酵液pH调节至2，4℃静置12h，4℃下10000 r/min离心20 min，分别收集上清液和沉淀物，沉淀物加入甲醇反复抽提至无色，合并得甲醇提取液，用1 moL/L NaOH调节抽提液至pH 7.0，40 ℃下将提取液浓缩至50 mL，测定上清液和沉淀甲醇抽提物对小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）的抑菌活性；有活性的组分甲醇抽提物沉淀有明显的抑菌作用，可进一步进行分离纯化；（3）BMF01菌株发酵液甲醇抽提物的硅胶柱层析向BMF01菌株的甲醇提取液中加入适量硅胶，40 ℃减压浓缩得到粗提物样品，用于硅胶柱层析分离；采用干法上样法，将抽提物样品缓缓均匀加入硅胶柱内，用吸耳球轻轻敲击硅胶柱使样品紧实且表面平整在硅胶柱口塞入适量棉花，分别以1 L石油醚，石油醚:二氯甲烷=1:1，二氯甲烷，二氯甲烷:甲醇=50:1，二氯甲烷:甲醇=10:1，二氯甲烷:甲醇=5:1，二氯甲烷:甲醇=1:1和甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，用真空泵边抽真空边收集洗脱液洗脱下来的组分，每个梯度洗脱夜收集后分别在40 ℃减压浓缩至20 mL；共收集得到8个组分；以小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）为指示菌，采用牛津杯法测定8个不同组分的抑菌活性；得到抑菌效果最好，抑菌带宽度达到分别为41.3 mm和42.0 mm的D组分和MD组分；（4）Sephadex LH‑20 柱层析采用Sephadex LH‑20层析法进一步分离硅胶柱层析后分离得到的抑菌活性组分MD组分；葡聚糖凝胶层析柱（1.5×50 cm）层析，所用色谱分离介质为Sephadex LH‑20，湿法上样，以二氯甲烷‑甲醇（3:2）为洗脱液进行等度洗脱，流速4 mL.h‑1，每管收集2~3 mL，洗脱液通过薄层色谱法（TLC）分析，合并相同组分，得到10个组分，以小麦根腐病菌（B. Sorokiniana）为指示菌，采用牛津杯法测定10个组分的抑菌活性；得到从 MD组分中分离出来的抑菌带宽度为30.00 mm的MD‑4组分；TLC检测表明MD‑4组分条带单一且清晰，采用高效液相色谱法分析表明，MD‑4组分在11.5 min时出现吸收峰且纯度较高，用于结构鉴定；（5）抑菌活性组分的结构鉴定采用7890‑5975 GC/MS法对具有抑菌活性的MD‑4组分进行结构鉴定；条件为：进样口温度250 ℃，流速1 mL/s，柱温程序初温40 ℃，辅助通道温度280 ℃，进样量1 µL，不分流进样，升温程序：40 ℃保持1 min，以30 ℃/min速度升至130 ℃，再以5 ℃/min升至250 ℃，10 ℃/min升至280 ℃保持6 min；离子源为EI，离子源温度150 ℃，四级杆温度150 ℃，发射电流34.6 µA，溶剂延迟6 min，载体为高纯氦气；MD‑4组分经GC/MS法分析，在保留时间31.2 min时出现单一峰；对该峰的组分进行离子扫描分析，根据扫描图谱分析确认该化合物为13‑碳二十二烯酰胺。