[发明专利]一种基于流式细胞术检测结核特异性双细胞因子的方法

摘要

本发明涉及医学检测领域，公开了一种基于流式细胞术检测结核特异性双细胞因子的方法，包括1）外周血单个核细胞制备；2）诱导结核特异性淋巴细胞产生IFN‑γ和TNF‑α的细胞培养体系的建立；3）流式细胞术检测CD4+T淋巴细胞胞内IFN‑γ和TNF‑α细胞因子。本发明以多色流式细胞术为检测平台，建立多色标记术，同时检测CD4+T淋巴细胞释放TNF‑α和IFN‑γ的技术（TB.FACS），以互补双细胞因子释放诊断结核病的各自优势，同时发挥流式细胞术可定量、特异性分析目标细胞群、快速和可单个标本检测的特点。

主权项

一种基于流式细胞术检测结核特异性双细胞因子的方法，其特征在于包括以下步骤：1）外周血单个核细胞制备：用真空肝素抗凝管采集入选对象外周血4‑6mL，与淋巴细胞分离液按1:1.8‑2.2的比例加入离心管中，其中淋巴细胞分离液先加入离心管底部，血液加在淋巴细胞分离液上层，离心处理；将外周单个核细胞层吸至新的离心管，加RPMI1640培养基9‑11mL洗涤离心处理，弃去上清液，再次加RPMI1640培养基9‑11mL吹打混匀，再次洗涤离心处理，弃去上清液，加含胎牛血清的RPMI1640培养基，并将单个核细胞数调整至1.8‑2.2×106/mL；2）诱导结核特异性淋巴细胞产生IFN‑γ和TNF‑α的细胞培养体系的建立：将重悬于含胎牛血清培养基的外周血单个核细胞分为3管，每管0.4‑0.6mL；其中，第一管阴性对照管：加入CD28和CD49d各0.8‑1.2ug/mL，莫能菌素9‑11ug/mL；第二管阳性对照管：加入PMA9‑11ug/mL，ION 0.8‑1.2ug/mL，CD28和CD49d各0.8‑1.2ug/mL，莫能菌素9‑11ug/mL；第三管测定管：加入ESAT‑6和CFP‑10各4.5‑5.5ug/mL，CD28和CD49d各0.8‑1.2ug/mL，莫能菌素9‑11ug/mL；放入36‑38℃，4‑6％CO2培养箱中培养16～18h；3）流式细胞术检测CD4+T淋巴细胞胞内IFN‑γ和TNF‑α细胞因子：将培养后的细胞离心处理，弃去上清液，加CD3‑PerCP 4.5‑5.5uL，CD8‑APC 2‑3uL，避光12‑18min；加破膜剂Ⅰ液18‑22uL，避光12‑18min；离心处理，弃去上清液，加破膜剂Ⅱ液18‑22uL，轻摇4‑6min，加IFN‑γ‑FITC和TNF‑α‑PE各4.5‑5.5uL，避光25‑35min；调整流式细胞仪中前向与侧向散射光的电压，圈出淋巴细胞群，以此为门构建SS与CD3的散点图，圈出CD3+细胞群，以此群为门，构建SS与CD8的散点图，圈出CD8－细胞群，以此为门构建IFN‑γ和TNF‑α的散点图，得出两个细胞因子阳性群的百分数，测定管的值减去阴性对照管的值即为检测结果。