[发明专利]一种基于微间隙阵列电极/滚环扩增技术检测DNA损伤的电化学传感方法

摘要

本发明提供一种基于微间隙阵列电极/滚环扩增技术检测DNA损伤的电化学传感方法。将引物与连接探针溶液进行连接反应，使酶失活，然后加入外切酶I，外切酶III，通过消解剩余的单链和双链DNA获得滚环模板；在phi29 DNA聚合酶和dNTPs的存在下，DNA引物与环状模板结合，触发RCA反应以产生具有重复序列的DNA长单链结构；利用捕获探针2修饰微间隙阵列电极，并加入滚环模板溶液与滚环扩增反应液，制备RCA/CP/HS‑P/MGESA电极并构建MWCNTs/RCA/CP/HS‑P/MGESA电化学传感平台。本方法具有高通量、高灵敏的优点，可以同时测定96个样品。摘要附图为96孔MGESA金电极板照片和电极单个孔的SEM照片。

主权项

一种基于微间隙阵列电极/滚环扩增技术检测DNA损伤的电化学传感方法，其特征在于具体步骤如下：（1）将捕获探针（HS‑P）滴加在微间隙阵列电极（MGESA）上，待修饰好后依次加入滚环模板CP和RCA反应液，RCA反应液通过DNA引物与环状模板结合触发，制备RCA/CP/HS‑P/MGESA电极；（1.1）将捕获探针HS‑P滴加在MGESA上，控制HS‑P浓度为1×10‑6mol/L‑1×10‑5mol/L，置于4℃冰箱中8‑10小时，修饰后将DNA溶液吸出，洗涤几次后，浸泡15‑60min；（1.2）向步骤（1.1）制备的MGESA电极上加入滚环模板CP，杂交反应1‑5h；其中：滚环模板CP的浓度为1×10‑7mol/L‑5×10‑5mol/L；（1.3）向步骤（1.2）所得产物中加入RCA反应液，加超纯水补足到设定体积，在30℃恒温条件下反应1‑5h，即得RCA/CP/HS‑P/MGESA电极；所述RCA反应液包括：phi 29 DNA聚合酶1‑10μL，phi29聚合酶缓冲溶液4‑20μL，BSA0.8‑4μL，dNTPs0.8‑4μL；（2）通过RCA扩增形成DNA长链，与碳纳米管连接形成MGESA‑RCA‑MWCNTs，实现微间隙阵列电极的导通并产生信号；（2.1）将1mg多壁碳纳米管（MWCNTs，30‑50μm）分散在10mL含有聚乙二醇十八烷基醚（PEG）的PBS缓冲溶液中，超声处理后，得到均一稳定的黑色分散液，以相同方式处理1‑100μm长度的MWCNTs，将两种MWCNTs分散液稀释至相同浓度，按体积比1：1混合后，超声处理待用；（2.2）将制备的RCA / CP / HS‑P / MGESA电极与步骤（2.1）制备的MWCNTs溶液在室温下温育2‑3 h，然后用PBS溶液洗涤以终止反应，即得MWCNTs / RCA / CP / HS‑P / MGESA电化学传感平台；（3）用不同浓度的Fenton溶液产生·OH对DNA进行损伤，导致DNA‑MWCNTs结构被破坏，使原本导通的电极不同程度断开，在电化学阻抗测量中显示明显的电信号响应减小；（4）通过电化学阻抗法进行·OH引起的DNA损伤测试。