[发明专利]一种CD133免疫磁珠的制备方法

摘要

本发明公开了一种CD133免疫磁珠的制备方法，具体步骤如下磁珠的制备；磁性壳聚糖微球制备称取10克壳聚糖加到200ml 2％乙酸溶液中浸泡过夜，使之溶解；取1g Fe3O4纳米磁珠加入其中，室温下，300r/min条件下搅拌；加入200ml液体石蜡油，40℃下，300r/min条件下搅拌；温度升高至50℃，加入40ml甲醛，300r/min条件下，搅拌；向混合溶液中加入20ml 50％体积浓度的戊二醛，170r/min，60℃条件下搅拌，调节pH为10，搅拌2‑6h；反应结束后向反应体系中加入100ml石油醚，充分搅拌，用布氏漏斗进行抽滤，获得磁性壳聚糖微球颗粒，然后再用乙醇充分搅拌洗涤，去除乙醇后再用蒸馏水洗涤，在50℃条件下真空干燥；磁性壳聚糖微球的羧基化；羧基化的免疫磁珠与抗体的偶联。本发明具有稳定性好、灵敏度高等优点。

主权项

一种CD133免疫磁珠的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：一、磁珠的制备：1.1、在通氮气的条件下，将12.1g FeSO4·7H2O、23.5g FeCl3·6H2O溶解于800ml蒸馏水中，加热回流，加热至90℃时，在机械搅拌下把30ml氨水加入以上溶液中；1.2、1h后反应结束，在外加磁场作用下，弃上清；1.3、加入100ml乙醇，充分搅拌洗涤磁珠，在外加磁场下，收集磁珠，再用100ml蒸馏水洗涤，常温下真空干燥，即得Fe3O4纳米磁珠；二、磁性壳聚糖微球制备：2.1、称取10克壳聚糖加到200ml 2％乙酸溶液中浸泡过夜，使之溶解；2.2、取1g Fe3O4纳米磁珠加入其中，室温下，300r/min条件下搅拌15‑25min；2.3、加入200ml液体石蜡油，40℃下，300r/min条件下搅拌25‑35min；2.4、温度升高至50℃，加入40ml甲醛，300r/min条件下，搅拌25‑35min；2.5、向混合溶液中加入20ml 50％体积浓度的戊二醛，170r/min，60℃条件下搅拌，调节pH为10，搅拌2‑6h；2.6、反应结束后向反应体系中加入100ml石油醚，充分搅拌，用布氏漏斗进行抽滤，获得磁性壳聚糖微球颗粒，然后再用乙醇充分搅拌洗涤，去除乙醇后再用蒸馏水洗涤，重复3‑5次乙醇和蒸馏水的洗涤操作，在50℃条件下真空干燥；三、磁性壳聚糖微球的羧基化：3.1、取1g磁性壳聚糖微球，加入50ml异丙醇和50ml 30％的NaOH溶液，60℃搅拌25‑45min；3.2、滴入含有7g氯乙酸的异丙醇溶液20ml，每5min滴加2ml；3.3、60℃条件下反应7h，用稀盐酸中和；3.4、反应结束后，用乙醇充分搅拌洗涤，去除乙醇后再用蒸馏水洗涤，重复3‑5次乙醇和蒸馏水的洗涤操作，真空干燥；四、羧基化的免疫磁珠与抗体的偶联：4.1、取2mg羧基磁珠于2ml离心管中，加入500μL活化缓冲液，在漩涡振荡器上混合均匀，再将离心管放置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附，用微型台式真空泵把上清抽提掉；4.2、加入500μL活化缓冲液重新洗涤磁珠2遍，向磁珠中加入485μL活化缓冲液，再分别加入2.5mg碳二亚胺与2.5mg N‑羟基琥珀酰亚胺，在涡旋振荡器上混匀，室温活化2mg磁珠表面的羧基30min；4.3、加500μL活化缓冲液重新洗涤已经活化的磁珠3遍后，再用500μL偶联缓冲液洗涤磁珠2遍；4.4、加475μL偶联缓冲液重悬洗涤后的磁珠，再加25μL 6mg/ml的AC133抗体，使得磁珠表面活化的羧基同抗体AC133的氨基室温反应3h，将抗体偶联于磁珠表面，得到免疫磁珠；4.5、用500μL含有1％牛血清白蛋白的偶联缓冲液封闭磁珠30min；4.6、用500μL的偶联缓冲液洗涤封闭磁珠2遍，用500μL含0.02％Na3N、0.1％牛血清白蛋白、0.05％Tween‑20的pH7.4，0.01mol/L磷酸盐吐温溶液重悬磁珠，保存于4℃冰箱，制备即完成。