[发明专利]一种用于同时检测NDV、IBV和H9N2亚型AIV的多重RPA引物和探针及其检测方法

摘要

本发明公开了一种用于同时检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和H9N2亚型禽流感病毒的多重RPA引物和探针，所述多重RPA引物和探针是由检测新城疫病毒的引物和探针、检测传染性支气管炎病毒的引物和探针、检测H9N2亚型禽流感病毒的引物和探针组成，本发明多重RPA引物和探针特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明还公开了一种多重RPA同时检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和H9N2亚型禽流感病毒的方法，该方法包括引物合成、模板RNA提取、反转录、多重PCR扩增及扩增产物分析等步骤，该检测方法操作简单，稳定性好，为有效检测和鉴别常见禽呼吸道疾病的混合感染提供一种成本低、快速、特异的现场诊断方法。

主权项

1.一种用于同时检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和H9N2亚型禽流感病毒的多重RPA引物和探针组合物，其特征在于，所述多重RPA引物和探针组合物是由用于检测新城疫病毒的引物和探针、用于检测传染性支气管炎病毒的引物和探针、用于检测H9N2亚型禽流感病毒的引物和探针组成，其中，所述用于检测新城疫病毒的引物和探针的核苷酸序列为：上游引物P1：5’‑GCAGAGATCACTCACACTCACATCAGTATTTAGCAC‑3’(SEQ ID NO.1)，下游引物P2：5’‑GCAGAGATCACTCACACTCACATCAGTATTTAGCAC‑3’(SEQ ID NO.2)，探针Probe1：5’‑488‑CGGACATCTGCAACAGGGAGGGTATTCTTTT‑THF‑TACTCTGCGTTCCATC‑Spacer C3‑3’(SEQ ID NO.3)；所述用于检测传染性支气管炎病毒的引物和探针的核苷酸序列为：上游引物P3：5’‑CTTAACAAAACGGACTTAAATACCTACAGCTGGTCC‑3’(SEQ ID NO.4)，下游引物P4:5’‑CTAGGTAGCCCAAGCAACGGATGTATAAAGTGAGACAC‑3’(SEQ ID NO.5)，探针Probe 2：5’‑Fluoresceinamidite‑CATAGGTGTTCCATTGCAGTGCACTTTAGTGCCCTG‑THF‑ATGGCACCTGGCCACCTGTCAGG‑Spacer C3‑3’(SEQ ID NO.6)；所述用于检测H9N2亚型禽流感病毒的引物和探针的核苷酸序列为：上游引物P5：5’‑CACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAG‑3’(SEQ ID NO.7)，下游引物P6：5’‑CATGCCTGATTAGTGGGTTGGTGGTAGTCGCCATCTG‑3’(SEQ ID NO.8)，探针Probe 3：5’‑Digoxigenin‑GTTGCACTCAGTTACTCAACTGGTGCGCTTGCCAGTTG‑THF‑ATGGGTCTCATATACAACCG‑Spacer C3‑3’(SEQ ID NO.9)。