[发明专利]用于植物基因表达载体构建的质粒载体及其应用

摘要

本发明公开了一种用于植物基因表达载体构建的质粒载体及其应用。利用经大肠杆菌质粒pUC18改造的pKAFCR1和经双核农杆菌Ti质粒pBI121改造的pKAFCR100两种质粒，在pKAFCR1的35S启动子和NOS终止子之间引入多个克隆酶切位点MCS，然后将包含35S‑MCS‑NOS片段切下连接到pKAFCR100，从而构建成质粒载体pNULPGE200。经PCR等方法克隆得到的目的基因可以多种方式很方便地连接到该质粒载体的35S启动子与NOS终止子之间的多个克隆酶切位点MCS，使目的基因能够在植物体内稳定表达；该质粒载体还具有独立表达的卡那霉素NPT II耐性基因和sGFP绿色荧光蛋白报告基因，能够显著提高转基因植物细胞的选拔效果。

主权项

一种用于植物基因表达载体构建的质粒载体pNULPGE200，其特征在于，经PCR克隆得到的目的基因可方便地连接到pNULPGE200的35S启动子与NOS终止子之间的多个克隆酶切位点MCS，使目的基因能够在植物体内稳定表达；同时该质粒载体还具有独立表达的卡那霉素NPT II耐性基因和sGFP绿色荧光蛋白报告基因，能够显著提高转基因植物细胞的选拔效果；所述质粒载体pNULPGE200的构建，包括如下步骤：S1、在pKAFCR1质粒的35S启动子和NOS终止子之间引入多克隆酶切位点MCSS11、利用限制性内切酶Xba I和Sac I，对pKAFCR1质粒进行双酶切处理，切除其原有的Xba I到Sac I部分；S12、将双酶切后的pKAFCR1经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过常规的凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒获得已切除Xba I和Sac I部分的pKAFCR1；S13、人工合成以下两条单链DNA：CR1MCSin‑S：5’‑CTAGAGTTAACTTAATTAACCCGGGAGGCCTGGTACCCTCGAGGAGCT‑3’；CR1 MCS in‑A：5’‑CCTCGAGGGTACCAGGCCTCCCGGGTTAATTAAGTTAACT‑3’；然后采用温度梯度退火法，使两条单链DNA构成一条双链DNA片段，该片段含有Xba I、Hpa I、Pac I、Xma I(Sma I)、Stu I、Kpn I、Xho I和Sac/等多个克隆酶切位点MCS；反应条件为94℃ 3 sec，95℃ 5 min，95℃至25℃温度梯度0.1℃/sec，25℃ 15 min；S14、利用T4‑DNA连接酶或质粒连接用试剂盒将已切除Xba I和Sac I部分的pKAFCR1与人工合成DNA片段进行连接，连接后的重组质粒利用热激法转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中；S15、将转化后的大肠杆菌平涂于含有25mg/L青霉素的LB固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有MCS重组质粒的阳性菌落；S16、阳性菌落经25mg/L青霉素的LB液体培养基扩繁后，利用常规的质粒提取方法或质粒提取试剂盒提取重组质粒DNA并进行测序验证，该重组质粒命名为pKAFCR1’；S2、pNULPGE200质粒的构建S21、利用限制性内切酶Hind III和Pvu II，对pKAFCR1’进行双酶切处理，通过凝胶电泳分离、回收获得包含35S‑MCS‑NOS片段；S22、利用限制性内切酶Hind III和Stu I对pKAFCR100进行双酶切处理，通过凝胶电泳分离、回收获得双酶切后的pKAFCR100；S23、利用T4‑DNA连接酶或质粒连接用试剂盒将35S‑MCS‑NOS片段与酶切后的pKAFCR100进行连接，连接后的重组质粒利用热激法转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中；S24、将转化后的大肠杆菌平涂于含有50mg/L卡那霉素的LB培养基培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有35S‑MCS‑NOS重组质粒的阳性菌落；S25、将阳性菌落经50mg/L卡那霉素的LB培养基扩繁后，利用常规的质粒提取方法或质粒提取试剂盒提取重组质粒载体DNA，该重组质粒载体命名为pNULPGE200。