[发明专利]一种富含细胞因子的脂肪源性基质细胞复合移植材料的制备及其临床应用

摘要

本发明公开了一种富含细胞因子的脂肪源性基质细胞复合移植材料的制备及其临床应用。制备方法通过1)脂肪颗粒团的获取与纯化；2)纳米脂肪基质细胞的获取；3)纳米脂肪来源干细胞(NFSCs)的生物学特性及多向分化鉴定；4)富含细胞因子纤维蛋白胶的获取四个步骤制备移植材料，用于临床上面部、胸部及其它体表软组织凹陷畸形的修复与矫正。本发明基于基质血管成分促进创伤或创面修复并减少瘢痕增生、促进组织再生修复与器官重建的新技术，缩短患者的康复时间，提高康复质量，取得良好的疗效，为临床上细胞辅助的自体脂肪组织移植修复软组织或器官缺损、烧伤创面、难愈性创面及乳腺癌术后乳房重建提供实验依据与理论支持。

主权项

一种富含细胞因子的脂肪源性基质细胞复合移植材料的制备，其特征在于，制备方法包括以下步骤：1)脂肪颗粒团的获取与纯化选取大腿上段内外侧或下腹部为供区，用手持20ml针筒预留空气法低负压抽取，根据患者情况，选定脂肪供区位置后，局部肿胀液浸润麻醉，采用自行设计的多孔专用吸脂针进行抽吸，抽吸时由深层向浅层抽吸，扇形反复抽吸；将抽吸出来的脂肪颗粒，采用生理盐水冲洗备用；采取低速离心方法获取并纯化脂肪颗粒团，离心转速600rpm/min，离心时间2min，操作过程全程遵循无菌密闭操作原则，尽量减少脂肪组织与空气的接触时间；2)纳米脂肪基质细胞的提取将一部分脂肪颗粒团经机械捣碎乳化法制备富含脂肪干细胞的纳米脂肪基质细胞，将步骤1)初步处理后的颗粒脂肪经孔径0.5mm的滤网过滤，随后将颗粒脂肪经2个20mL注射针筒连接纳米脂肪专用乳化器快速对打30次，机械乳化，用0.5mm孔径的滤网再次过滤，最后经转速为8000rpm/min，离心时间为5min高速离心去除油脂后得到的脂肪乳化液即为纳米脂肪，这部分乳化后的纳米脂肪携带有较多的基质血管成分和脂肪干细胞，有利于增加基质血管成分与脂肪细胞的接触面，提高脂肪移植物的成活率，将机械乳化颗粒脂肪分离培养并传代后获得的间充质干细胞称为纳米脂肪来源干细胞；3)纳米脂肪来源干细胞的生物学特性及多向分化鉴定经步骤2)机械乳化后的纳米脂肪基质细胞含有较多的基质血管成分，培养24h后开始有少量成纤维细胞样形态的细胞散在贴壁，大部分未贴壁细胞为球形或圆形的杂细胞，24‑48h后首次换液去除未贴壁细胞后，大部分贴壁细胞呈宽大扁平的成纤维细胞样细胞，随着培养时间的延长，这些贴壁细胞呈集落状生长，集落大小不一；集落中细胞形态为典型的梭形细胞，约7‑10d可达80％～90％致密层单层，传代后细胞形态主要为梭形，生长速度较原代细胞明显增快，如果按1：3传代，2‑3d即可长满。连续传代培养10代细胞未出现明显衰老现象，传代后细胞经检测细胞倍增时间平均约为40h，各代细胞形态与传统胶原酶消化法获取的脂肪干细胞相似，第3代细胞经成脂诱导14d，可见细胞内有透亮的脂滴形成，油红O染色可见脂滴被染成鲜红色；成骨诱导21d后，可见典型的矿化钙结节形成，茜素红染色呈鲜红色；成软骨诱导14d后，可见高度聚集样生长的细胞团，呈斑片状或结节状，周围细胞呈放射状；结节较大，肉眼可见；阿利辛蓝染色提示结节及周边聚集的细胞呈蓝色；第3代纳米脂肪来源干细胞流式细胞分析显示CD29、CD44、CD49d、CD54、CD90和CD105呈阳性，而CD34、CD45和CD106呈阴性；4)富含细胞因子纤维蛋白胶的提取抽取同一个体的适量静脉血，置于的无菌负压采血管内，采用Choukroun’s法离心转速为2700rpm/min、离心时间为12min一次性高速离心提取富含细胞因子纤维蛋白胶；用20ml无菌注射器采集患者静脉血液20‑40ml，并密封盖封，将无菌的离心套管放入离心机中，然后将装有患者静脉血液的20ml注射器放入套管中，以转速为2700rpm/min离心12min，静置3～5min后弃上清，去除底层红细胞碎片，收集中间纤维蛋白凝胶层，过滤去除血清，将富含细胞因子的纤维蛋白胶收集备用；同时对PRF在1～168h时间段内进行细胞因子释放浓度的检测，结果发现血管内皮生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子‑β1、表皮生长因子、白细胞介素‑6、基质金属蛋白酶‑1和胰岛素样生长因子‑1的浓度呈上升趋势，这些细胞因子对促进组织修复和再生具有重要的作用。