[发明专利]14个功能性杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIRs基因同步测序分型的方法

摘要

本发明基于KIR基因组全长序列的结构特点、SNPs多态性分布以及外显子两翼的内含子的长度，制定了科学的PCR扩增策略，设计具有相近退火温度的KIR基因特异性PCR引物56对。每个功能性KIR基因的全部编码区序列分别采用3～5对特异性PCR引物进行扩增；纯化后的PCR扩增产物，采用特异性正向、反向测序引物对每一外显子进行双向测序反应。设计使用的测序引物共计230条。本发明首次建立了适合于高通量化KIR测序分型的方法，全部的14个功能性KIR基因可在同一PCR扩d增条件下进行同步扩增，并且所需时间短；测序分型涵盖了每个功能性KIR基因的全部编码区；所获得的序列无背景信号和杂峰，易于识别和结果判读。在群体遗传学、疾病关联、骨髓移植等领域具有良好的应用前景。

主权项

14个功能性杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIRs基因同步测序分型的方法，其特征在于，根据各KIR基因的基因组全长序列的结构、编码区单核苷酸多态性分布特点以及外显子两翼的内含子的长度，制定了PCR扩增策略：2DL1基因的编码区序列，采用5对2DL1基因特异性PCR引物进行扩增；其中第一对PCR引物扩增2DL1基因的第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’‑启动子区和部分第2内含子的序列；第二对PCR引物扩增2DL1的第4外显子及其两侧翼的部分序列；第三对PCR引物扩增2DL1的第5外显子及其两侧翼的部分序列；第四对PCR引物扩增2DL1的第6外显子及其两侧翼的部分序列；第五对PCR引物扩增2DL1的第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’UTR区的序列；2DL2、2DL3、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4及2DS5基因的编码区序列，均采用4对KIR基因特异性PCR引物进行扩增；第一对PCR特异性引物扩增第1外显子、第1内含子和第2外显子，以及部分5’‑启动子区和部分第2内含子的序列；第二对PCR特异性引物扩增第4外显子、第4内含子、第5外显子，以及部分第2/3内含子和部分的第5内含子；第三对PCR特异性引物扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列；第四对PCR特异性引物扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’UTR区的序列；2DL4、2DL5基因的编码区序列，均采用4对KIR基因特异性PCR引物进行扩增；第一对PCR特异性引物扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’‑启动子区和部分第2内含子的序列；第二对PCR特异性引物扩增第3外显子、第3/4内含子、第5外显子，以及部分第2内含子和部分第5内含子的序列；第三对PCR特异性引物扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列；第四对PCR特异性引物扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’UTR区的序列；3DL1、3DL2及3DS1基因的编码区序列，均采用4对KIR基因特异性PCR引物进行扩增；第一对PCR特异性引物扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’‑启动子区和部分第2内含子的序列；第二对PCR特异性引物扩增第3外显子、第3内含子、第4外显子、第4内含子、第5外显子，以及部分第2内含子和部分第5内含子的序列；第三对PCR特异性引物扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列；第四对PCR特异性引物扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’UTR区的序列；3DL3基因的编码区序列，因缺失了第6外显子、该外显子无需扩增，仅用3对3DL3基因特异性PCR引物进行扩增；第一对PCR特异性引物扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’‑启动子区和部分第2内含子的序列；第二对PCR特异性引物扩增第3外显子、第3内含子、第4外显子、第4内含子、第5外显子，以及部分第2内含子和部分第5内含子的序列；第三对PCR特异性引物扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’UTR区的序列；每个功能性KIR基因的全部编码区序列分别采用3～5对具有相近退火温度的KIR基因特异性PCR引物进行PCR同步扩增；其中，所述KIR基因特异性PCR扩增引物，除了KIR3DL3因缺失第6外显子仅用3对PCR引物、KIR2DL1采用5对PCR引物外，其余的每个功能性KIR基因均采用4对PCR引物；PCR引物共56对，计112条；每条PCR引物的序列、在KIR基因组全长序列中的位置，以及扩增目的片段的长度特征，如表1所述；针对纯化后的PCR扩增产物所含的每一外显子，分别进行正向、反向双向测序。