[发明专利]一种基于光激活的单分子荧光共振能量转移的方法

摘要

一种基于光激活的单分子荧光共振能量转移的方法，属于生物大分子成像技术领域。该方法利用光激活荧光染料对生物样品进行标记作为供体，用波长为200‑450纳米的激活光源使得光激活的荧光染料发生顺反异构、电子传递或者化学键断裂等化学反应，使之从不发射荧光状态(非激活态)转变为可发射荧光状态(激活态)；此时利用波长为450‑1200纳米的激发光源可激发其发射荧光。当供体与非光激活的荧光染料标记的受体的距离在1‑10纳米之间时，供体的能量就会转移给受体，即发生荧光共振能量转移。本方法的优点是突破荧光共振能量转移技术中的荧光样品浓度的障碍(50nM左右)，从而实现在接近生理条件的微摩尔浓度下进行单分子荧光共振能量转移的测量。

主权项

1.一种基于光激活的单分子荧光共振能量转移的方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：1)将光激活荧光染料和非光激活荧光染料分别溶解在有机溶剂中，染料终摩尔浓度为每升1‑50毫摩尔；所述光激活荧光染料包括CAGE 500、CAGE552、CAGE 590或CAGE 635；所述非光激活荧光染料包括Cyanine2、Cyanine3、Cyanine5、Cyanine7、Alexa 488、Alexa 647或atto 488；2)光激活荧光染料和非光激活荧光染料分别标记生物样品蛋白或核酸，生物样品的摩尔浓度为每升10‑200微摩尔，生物样品浓度和荧光染料浓度的比例为1：1‑10；生物样品和荧光染料在4℃‑37℃下反应0.5‑24小时；3)将步骤2)反应后的溶液加入脱盐柱中，用缓冲液洗脱得到标记荧光染料的生物样品，从而去除多余的没有标记生物样品的荧光染料；4)用光激活荧光染料标记的生物样品作为供体，用非光激活荧光染料标记的生物样品作为受体；将非光激活荧光染料标记的生物样品固定在玻片上，之后加入浓度为每升纳摩尔到每升微摩尔量级的光激活染料标记的生物样品，在全内反射荧光显微镜下进行成像；打开波长为200‑450纳米的激活光源(6)，使玻片表面附近的光激活荧光染料都转变为可发射荧光的激活态；5)关闭激活光源，打开另一波长为450‑1200纳米的激发光源(7)，与表面的生物样品结合的激活态荧光染料会被激发产生荧光；6)当光激活荧光染料标记的供体与非光激活的荧光染料标记的受体的距离为1nm‑10nm时，通过激活和激发光源的交替照明，不断的激活在实验观测过程中结合到表面的荧光染料，供体的能量就会转移给受体，受体就会发出相应的荧光，即荧光共振能量转移。