[发明专利]一种仔猪大肠杆菌血清型鉴定及其毒力因子检测方法

摘要

本发明公开了一种仔猪大肠杆菌血清型鉴定及其毒力因子检测方法，属于仔猪养殖防病技术领域。所述的方法包括细菌分离及纯化、待检菌株生化鉴定、大肠杆菌O血清型鉴定；大肠杆菌O抗原定型血清型鉴定、和大肠杆菌毒力因子检测的步骤。本发明对分离的64株仔猪源致病性大肠杆菌血清型进行鉴定和毒力因子基因PCR检测，结果显示仔猪源大肠杆菌的血清型复杂，地区分布广泛，且差异较大，为本地区筛选优势血清型且具有良好免疫原性的菌株制备多价苗提供数据参考。

主权项

一种仔猪大肠杆菌血清型鉴定及其毒力因子检测方法，其特征在于：所述的方法包括如下步骤，步骤1：细菌分离及纯化；取病料样品于含体积百分数2％血清的TSA琼脂培养基上划线培养，37℃培养18～24h；然后挑取单菌落继续在麦康凯培养基上传代培养，稳定纯化3代后，单菌落再接种于LB培养基中，进行纯菌增殖，得到分离菌，‑80℃甘油冻存，备用；步骤2：待检菌株生化鉴定；将步骤1得到的分离菌分别作吲哚试验、甲基红试验、VP试验、构椽酸盐利用试验和三糖铁琼脂试验，逐一鉴定筛选，大肠杆菌参考菌株ATCC 25922作对照，筛选出的菌株，再做葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、尿素发酵试验；确定分离菌为大肠杆菌；步骤3：大肠杆菌O血清型鉴定；抗原的制备：取分离菌光滑菌落接种于普通琼脂斜面小管，置于37℃培养箱中培养24h，用2mL0.5％石炭酸生理盐水洗下普通琼脂斜面小管培养物，置于小圆底试管，用塞子塞住，制成浓稠菌悬液，121℃高压2h，破坏其K抗原，制成高压抗原；步骤4：大肠杆菌O抗原定型血清型鉴定；先进行玻片凝集试验初步筛选O血清型，然后通过试管凝集试验确定其O血清型；定型标准为血清的试管凝集价≥640；步骤5：大肠杆菌毒力因子检测；大肠杆菌DNA模板制备：按照细菌DNA基因组提取试剂盒方法进行操作，提取大肠杆菌DNA，‑20℃保存备用；引物设计与合成；PCR扩增：以提取的DNA基因组作为模板，进行PCR扩增，检测分离菌对毒力因子的携带情况。