[发明专利]一种抗胶孢炭疽菌的铁皮石斛的培育方法

摘要

本发明涉及一种抗胶孢炭疽菌的铁皮石斛的培育方法，该方法由原球茎诱导、EMS(甲基磺酸乙酯)诱变原球茎、原球茎的分化和采用针刺法进行抗性筛选四个步骤组成。本发明所述培育方法的效率高，重复性好，且诱变后代易稳定遗传，具有较好的推广价值。

主权项

一种抗胶孢炭疽菌的铁皮石斛的培育方法，该方法由以下步骤组成：(1)选取铁皮石斛饱满、近成熟未开裂的蒴果，用体积浓度为75％酒精棉球擦拭，然后置于质量浓度为0.1％汞溶液中消毒15min，再用无菌水冲洗4～5次；取出处理好的蒴果的种子接种于种胚诱导培养基中，于温度为25±2℃、光照强度为2000lx的条件下培养90d，得到铁皮石斛原球茎；其中所述的种胚诱导培养基为每升含50g马铃薯汁的1/2MS培养基；(2)将获得的原球茎在超净台中加入体积浓度为0.3‑0.4％的无菌EMS溶液，密闭并震荡培养2‑3h；接着，用质量浓度为1％硫代硫酸钠处理5s，再用无菌水反复漂洗后接种于原球茎培养基中，于温度为25±2℃，光照强度为2000lx的条件培养45d；然后，挑选分化芽少、芽长健壮、颜色绿和无愈伤的原球茎；其中所述的原球茎培养基为：1/2MS+50g/L马铃薯汁+1g/L酸水解干酪素+0.8g/L Hyponex 4+2g/L活性炭+30g/L蔗糖+10g/L琼脂，pH值为5.8；(3)将经步骤(2)培养的原球茎在温度为25±2℃和光照强度为2000lx的条件下，依次分别用含50％与80％体积含量胶孢炭疽菌粗毒素液的再生培养基培养30d；然后，剔除白化、黄化和根及叶片出现褐化的小苗，而将其余的小苗转入所述再生培养基中继续诱导分化30d；接着，将诱导分化后小苗移至壮苗生根培养基中，在温度为25±2℃和光照强度为2000lx的条件下进行壮苗生根培养60d，得到生根的壮苗；其中，所述的再生培养基为：1/2MS+50.0g/L马铃薯汁+1.0g/L酸水解干酪素+0.8g/LHyponex 4+NAA 1.0mg/L+6‑BA 0.5mg/L+2.0g/L活性炭+30g/L蔗糖和10g/L琼脂，pH值为5.8；所述的壮苗生根培养基为：1/2MS+50g/L马铃薯汁+1.0g/L酸水解干酪素+0.8g/LHyponex 4+NAA 1.0mg/L+2g/L活性炭+30g/L蔗糖+10g/L琼脂，pH值为5.8；所述的胶孢炭疽菌粗毒素液由以下方法制得：将经过单胞纯菌丝培养，Illumina测序技术鉴定为Colletotrichum gloeosporioides的胶孢炭疽菌菌株于PDA培养基中活化，28℃连续培养7天；用打孔器取出3块直径5mm的菌饼于500mL液体改良察氏培养基中，在25±2℃和100‑120r/min的条件下，振荡摇床黑暗培养12d，滤去菌丝后，滤液经10000rpm离心15min，取上清液无菌过滤，即得胶孢炭疽菌粗毒素液；其中所述的改良察氏培养基为：NaNO33g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01，蔗糖20g，蒸馏水1L；(4)将经步骤(3)培养的壮苗种植于田间，成活后先用解剖针在每片叶子上刺10针，然后涂抹胶孢炭疽菌孢子混悬液，每株接种5片叶子；20‑25d后进行病情调查，挑选健康的植株，即得抗胶孢炭疽菌的铁皮石斛幼苗；其中所述的胶孢炭疽菌孢子悬浮液由以下方法制得：将试管内保存的炭疽菌，接种于PDA平板培养基上，在28℃暗培养3‑4天，挑取菌落边缘菌丝，于PDA平板上28℃暗培养10天，用灭菌的蒸馏水洗脱分生孢子，用消毒的毛笔轻刷菌落表面，过滤，收集孢子悬浮液，用血球计数板计数，使孢子的终浓度为1×106spores/ml，即得胶孢炭疽菌孢子悬浮液。