[发明专利]基于ARMS-PCR法检测BMP3和NDRG4基因甲基化的荧光PCR方法、试剂盒及体系

摘要

本发明公开了一种基于ARMS‑PCR法检测BMP3和NDRG4基因甲基化的荧光PCR方法、试剂盒及体系。方法包括：(a)对含有BMP3和NDRG4基因的DNA材料中的CpG位点进行转换处理，使得未甲基化的CpG位点转换为UpG；(b)以转换处理后的DNA材料作为模板进行荧光PCR反应，荧光PCR体系中包括：用于检测BMP3基因甲基化的特异性引物及其探针序列，用于检测NDRG4基因甲基化的特异性引物及其探针序列，Taq酶、UNG酶、dNTPs、dUTP、Mg2+和PCR缓冲液，第一添加剂和第二添加剂，其中第一添加剂包括牛血清白蛋白，第二添加剂包括二甲基亚砜、NH4Cl和山梨糖醇水溶液。本发明的方法能够避免1个CpG位点甲基化代表整个基因甲基化水平的假阳性现象；甲基化水平检测限低至0.1～1％，灵敏度高。

主权项

一种基于ARMS‑PCR法检测BMP3和NDRG4基因甲基化的荧光PCR方法，其特征在于，包括：(a)对含有所述BMP3和NDRG4基因的DNA材料中的CpG位点进行转换处理，使得未甲基化的CpG位点转换为UpG；(b)在荧光PCR体系中，以所述转换处理后的DNA材料作为模板进行荧光PCR反应，其中所述荧光PCR体系中包括：(b1)用于检测BMP3基因甲基化的特异性引物及其探针序列：上游引物序列为：GAGTTTAAGTTTCGGTTTCdITC(SEQ ID NO：1)，荧光探针序列为：GCAAAAAACCGACGACGAAA(SEQ ID NO：2)，下游引物序列为：GTCGCTACGCAACACTdICG(SEQ ID NO：3)；(b2)用于检测NDRG4基因甲基化的特异性引物及其探针序列：上游引物序列为：TTTCGCGTCGCGGTTGTCGdITC(SEQ ID NO：4)，荧光探针序列为：TTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGT(SEQ ID NO：5)，下游引物序列为：GTCGCTACGACACACTdICG(SEQ ID NO：6)；其中，所述引物序列中的dI表示脱氧次黄嘌呤核苷酸；所述荧光探针序列的5’端具有荧光基团，3’端具有淬灭基团和小沟结合分子；(b3)Taq酶、UNG酶、dNTPs、dUTP、Mg2+和PCR缓冲液；(b4)第一添加剂和第二添加剂，所述第一添加剂包括牛血清白蛋白，所述第二添加剂包括二甲基亚砜、NH4Cl和山梨糖醇水溶液。