[发明专利]应用数字PCR检测尿液中人乳头瘤病毒16/18型基因的方法

摘要

本发明公开了一种应用数字PCR检测尿液中人乳头瘤病毒16/18型基因的方法，具体步骤为尿液中 DNA的抽提；制备引物反应溶液；制备微滴；PCR扩増；检测微滴；分析数据以及显示结果，裂解液的组分构成为10mM Tris‑HCl，1mM  EDTA,0.5% SDS，乙酸钠溶液的pH值为 5.2。本发明提供了一种取样无创、不受年龄限制且易获得的检测方式，而且具有高灵敏度和高精确度结，弥补了尿液中病毒核酸稀少造成的检测难度，可使尿液检测HR‑HPV广泛应用于临床诊疗工作和宫颈癌的筛查,对宫颈癌的防治具有重要意义等优点。

主权项

一种应用数字PCR检测尿液中人乳头瘤病毒16/18型基因的方法，其特征在于：具体步骤为：步骤一、尿液中 DNA的抽提：a、收集30ml尿液样本，在4℃的条件下， 5000rpm 离心 10min，收集底部的沉淀；b、向步骤a收集的沉淀内加入1.0ml TE 缓冲液 ，混匀，8000rpm 离心5min，收集底部的沉淀；c、向步骤b收集的沉淀内加入1.0ml TE 缓冲液 ，混匀，8000rpm 离心5min，收集底部的沉淀；d、向步骤c收集的沉淀内加入450ul 裂解液和10ul 蛋白酶K， 在55℃的条件下，水浴1小时，沉淀溶解，得到混合液；e、将混合液取出，冷却至室温后加入等体积的饱和酚，混匀，5000 rpm离心10min，弃上清；f、加入432μL的氯仿和18μL的异戊醇，混匀，5000 rpm 离心10min，弃上清；g、加入占步骤f制得的混合液1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液，再加入2.5倍步骤f制得的混合液体积的无水乙醇,混匀，在‑20℃ 的条件下放置1h后，10000rpm离心15min，弃上清；h、采用0.6mL的70%乙醇溶液洗涤2次，晾干后，加入50μL TE缓冲液，完成了对尿液中 DNA的抽提，得到了DNA模板；i、将所有提取的DNA模板均用看家基因β‑actin进行PCR检测，以确认DNA模板中含有人类DNA，将扩增结果阳性标本确认为有效的DNA模板，在－20℃的条件下保存备用；步骤二、制备引物反应溶液：室温溶解HPV16 E7的PCR引物、HPV18 E7的PCR引物以及TaqMan探针，配置20 µL引物反应溶液，引物反应溶液包含 10 µL 2×dd PCR Master Mix、10 µmol/L 的正向引物和10 µmol/L的反向引物各0.8 µL、TaqMan‑MGB探针0.5 µL、DNA 模板 2 µL、无菌水6 µL，阴性对照组中，使用不含DNA的TE缓冲液作为模板；步骤三、制备微滴：将20 uL上述引物反应溶液转入DG8微滴发生卡中并放入QX100微滴发生器内，在每个孔中加入70 µL 微滴生成油，然后置于微滴生成卡中，覆盖专用胶垫后置入微滴生成仪，生成微滴；步骤四、PCR扩増：将样本生成的微滴手动转移到96孔PCR板上，孔板用锡箱热封后进行PCR扩增；步骤五、检测微滴：PCR反应后，将96孔PCR板置于QX100微滴分析仪中，依次吸取每个样本中的微滴并随载液流逐一通过检测器，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性；步骤六、分析数据以及显示结果：采用QuantaSoft软件分析ddPCR数据确定等位基因分型，当样本中至少有2个微滴出现在FAM信号的阳性区域时，认为该样本此突变为阳性，否则为阴性。