[发明专利]通过核递送CRISPR/CAS9追踪并操纵细胞RNA

摘要

本发明提供了靶向RNA的Cas9多肽及其使用方法。

主权项

1.一工程化核蛋白复合物，其包含：(a)Cas9多肽，和(b)重组或合成单向导RNA(sgRNA)，其被改造或设计为包含：(1)在其5'末端，通过杂交(与靶RNA杂交或结合)识别靶RNA的一RNA序列，和(2)在其3'末端：(i)能够结合或缔合Cas9多肽的RNA序列(结合Cas9多肽的“支架序列”)，或(ii)接头，其与所述Cas9多肽结合或共价或非共价连接1所述sgRNA的5'RNA杂交或结合末端，其中任选地所述核蛋白复合物不包含PAMmer寡核苷酸，且任选地所述Cas9多肽：(6)是或来源于细菌或古细菌Cas9多肽，(7)缺少对应的野生型(WT)Cas9多肽的结构域或结构域的一部分，其中所述结构域任选地是Cas9的HNH和/或RuvC核酸酶结构域，包含ββα‑金属折叠，所述ββα‑金属折叠包含或包括Cas9多肽的活性部位或其组合；(8)缺乏DNA酶或DNA切割的能力或活性、切口酶活性或其组合，其中任选地，通过修饰(突变)或去除全部或部分HNH和/或RuvC Cas9的核酸酶结构域、Cas9多肽DNA酶活性位点或包含Cas9多肽活性位点的ββα‑金属折叠或其组合，以去除DNase或DNA切割能力或活性，(9)缺少Cas9的HNH和/或RuvC核酸酶结构域、Cas9多肽DNase活性位点、包含Cas9多肽活性位点的ββα‑金属折叠或其组合的全部或部分，从而任选地减小多肽的尺寸，任选地促进将Cas9编码核苷酸包装在病毒或其他递送载体中，或(10)是WT Cas9多肽的变体，并且具有一个或多个氨基酸突变，其导致相对于相应的WT Cas9多肽的DNase或核酸酶活性降低，或任选地，古细菌或细菌Cas9多肽是、包含或源自：地中海富盐菌(Haloferax mediteranii)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、土拉热弗朗西菌新凶手亚种(Francisella tularensis subsp.novicida)、多杀性巴氏杆菌(Pasteu rella multocida)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejune)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)LMD‑9 CRISPR 3、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)CF89‑12株、鸡毒支原体菌(Mycoplasma gallisepticum str.)株F、硝化裂化器菌(Nitratifractor salsuginis str)DSM 16511株、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)，灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、重氮营养葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)、固氮螺菌(Azospirillum)B510，螺旋体球菌巴迪菌株(Sphaerochaeta globus str.Buddy)、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)，Fluviicola taffensis、嗜粪拟杆菌(Bacteroides coprophilus)、运动型支原体(Mycoplasma mobile)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)，巴斯德链球菌(Streptococcus pasteurianus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、伪中间型葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedins)、产线龈沟菌(Filifactor alocis)、牙密螺旋体(Treponema denticola)、嗜肺军团杆菌巴黎株(Legionella pneumophila str.Paris)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、白喉棒状杆菌(Corynebacter diphtheriae)、金黄葡萄球菌(Streptococcus aureus)和新凶手弗朗西菌(Francisella novicida)(任选地是新凶手弗朗西菌Cpfl)或格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute蛋白，其被修饰或赋予新用途以靶向RNA，其中任选地sgRNA 3'末端或“支架序列”包含每一个这些相应细菌或古细菌生物中的野生型(WT)或源自野生型的同源向导核酸的全部或部分。