[发明专利]一种通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法

摘要

本发明公开一种通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法，是将胆碱脱氢酶基因betA和磷酸乙醇胺甲基转移酶基因GhPEAMT利用表达载体pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑EPSP和pCAMBIA1300‑betA‑als重组构建植物表达载体pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑betA‑EPSP，并将其转入棉花细胞中让其高效表达，进而再生出转基因植株；利用苗期喷洒除草剂草甘膦获得抗性小苗，结合常规分子检测技术，从抗性植株及其后代中筛选出转基因纯合体；再在盐碱池或干旱棚中筛选鉴定出耐盐耐旱性显著提高的转基因纯合体，即获得通过增加甜菜碱合成能力创建出的棉花耐盐抗旱育种新种质。本发明方法建立了以磷酸乙醇胺为原料合成甘氨酸甜菜碱的代谢途径，实验证实转基因后的棉花耐盐抗旱特性显著提高。

主权项

一种通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法，是将来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因betA和来自植物的磷酸乙醇胺甲基转移酶基因GhPEAMT利用植物表达载体pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑EPSP和植物表达载体pCAMBIA1300‑betA‑als重组构建植物表达载体pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑betA‑EPSP，并将其转入棉花细胞中让其高效表达，进而再生出转基因植株；利用苗期喷洒除草剂草甘膦获得抗性小苗，结合常规分子检测技术，从抗性植株及其后代中筛选出转基因纯合体；再在盐碱池或干旱棚中筛选鉴定出耐盐抗旱性显著提高的转基因纯合体，即获得通过增加甜菜碱合成能力创建出的棉花耐盐抗旱育种新种质；其特征在于：所述构建重组植物表达载体pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑betA‑EPSP的方法是：(1)BamHI和KpnI双酶切植物表达载体pCAMBIA1300‑EPSP，回收载体；BamHI和KpnI双酶切克隆载体pUC57‑GhPEAMT回收GhPEAMT片段；将回收的植物表达载体pCAMBIA1300‑EPSP的载体部分与回收的克隆载体pUC57‑GhPEAMT中的目的基因GhPEAMT连接，获得中间植物表达载体，命名为pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑EPSP；(2)EcoRI酶切回收中间植物表达载体pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑EPSP的载体部分，通过引物用高保真DNA聚合酶从植物表达载体pCAMBIA1300‑betA‑als中扩增得到两端引入EcoRI酶切位点的片段35S‑betA‑nos并用EcoRI酶切后回收；将回收的中间植物表达载体pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑EPSP的载体部分与回收的35S‑betA‑nos片段连接，得到重组植物表达载体，命名为pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑betA‑EPSP；其中所述引物的核苷酸序列为：NOS‑B 5'CGAATTCCCGATCTAGTAACATAG 3'；35S‑B 5'GGAATTCGTCCCCAGATTAGCCTTTTC 3'；所述棉花细胞是茎尖分生组织细胞、离体培养的幼胚细胞、成熟胚细胞、胚性愈伤组织细胞或原生质体；所述利用苗期喷洒除草剂草甘膦获得抗性小苗，结合常规分子检测技术，从抗性植株及其后代中筛选出转基因纯合体的方法是：通过对3～4叶期转基因棉花小苗喷洒1.6～1.8‰草甘膦检测转基因植株的抗性，用除草剂筛选获得抗性植株，然后对抗性植株利用PCR、southern杂交技术检测获得转基因纯合植株。