[发明专利]一种马铃薯病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种马铃薯病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用，马铃薯病毒快速检测试纸条，包括样品垫、金标垫、NC膜、检测线T线、质控线C线、吸水垫和PVC底板；其制备方法包括金标垫的制备、NC膜的制备、样品垫的制备、试纸条的组装四个步骤；具体应用检测步骤为：样品处理、滴加样品、结果判读等步骤；马铃薯病毒包括PVX、PVY^NTN、PVY^o、PLRV、PVS、PVM、PVA和番茄黑环病毒。本发明使用方便、适用性强、无需实验室、不需要任何特殊仪器、无需专业人员操作培训、田间地头、马铃薯贮藏窖、海关等任何有马铃薯的地方即可测试，每个马铃薯种植者均会使用。

主权项

1. 一种马铃薯病毒快速检测试纸条，包括样品垫(1)、金标垫 (2)、NC膜(3)、检测线T线(4)、质控线C线(5)、吸水垫(6)和PVC底板(7)，所述PVC底板(7)的上部贴合有NC膜(3)，所述NC膜(3)上部两端分别搭接有金标垫（2）和吸水垫（6），所述金标垫(2)上部搭接有样品垫(1)，所述检测线T线(4) 设置在靠近样品垫(1)的NC膜(3)表面上，所述质控线C线(5) 设置在靠近吸水垫(6)的NC膜(3)上，其特征在于：所述检测线T线(4)上包被有马铃薯病毒兔多克隆抗体，包被在检测线T线(4)上的马铃薯病毒兔多克隆抗体溶液划膜浓度为0.5‑1.5µL/cm，用来进行划膜的马铃薯病毒兔多克隆抗体溶液的浓度为0.5‑1.5mg/mL；所述质控线C线(5)上包被有马铃薯病毒羊抗兔抗体，包被在质控线C线(5)上的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液划膜浓度为0.5‑1.5µL/cm，用来进行划膜的马铃薯病毒羊抗兔抗体溶液的浓度为0.5‑1.5mg/mL；所述金标垫(2)上结合有马铃薯病毒胶体金标记物，结合在金标垫(2)上的马铃薯病毒胶体金标记物溶液喷涂浓度为4‑6µL/cm；所述马铃薯病毒快速检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：步骤1：金标垫(2)的制备： 1) 马铃薯病毒胶体金标记物的制备：用胶体金溶液标记马铃薯病毒兔多克隆抗体，马铃薯病毒兔多克隆抗体的浓度为0.5‑1.5mg/mL；复溶液配方：pH8.0‑8.8，8‑12%蔗糖，3‑6%海藻糖，0.5‑2%牛血清白蛋白，溶剂为0.1‑0.2mol/L的 Tris‑HcL溶液；胶体金溶液的制备：取297‑300 mL超纯水于圆底烧瓶中，加入2‑4 mL浓度为1‑2%氯金酸溶液，混匀；将圆底烧瓶置于恒温器中，加入干净搅拌子，低速搅拌并加热沸腾；一次性加入2‑4mL、1‑2%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸；时刻观察溶液颜色变化，由浅黄色→黑色→紫色→紫红色，当变为酒红色时，继续煮沸4‑6min，停止加热，冷却至室温；超纯水做空白对照，扫描胶体金溶液在500‑550nm 之间的吸收值，如果吸收峰值在515‑525nm出现，则制备的胶体金溶液合格；马铃薯病毒胶体金标记物的制备工艺：取2支离心管，加入1‑2mL 胶体金溶液，加入3‑5µL 0.1mol/L 的K₂CO₃，再加入4‑6µL马铃薯病毒兔多克隆抗体，静置25‑35min，再加入80‑120µL 封闭剂，静置25‑35min,在8000‑10000rpm、4℃条件下离心25‑35min ，弃上清，加入80‑120µL复溶液悬浮沉淀，在400‑600rpm、4℃条件下离心10‑20min ，吸取上清液，保存备用；2) 金标垫(2)与马铃薯病毒胶体金标记物的结合：选用玻璃纤维膜作为金标垫的支撑材料，将步骤1)制备的马铃薯病毒胶体金标记物，用三维大平台喷金划膜仪喷涂在玻璃纤维膜上，在玻璃纤维膜上喷涂马铃薯病毒胶体金标记物的最佳喷涂浓度为4‑6µL/cm，将喷好的玻璃纤维膜置于35‑40℃ 干燥箱中，干燥时间2‑4h，取出，放入铝箔袋中，180‑230℃ 热合封口，保存备用；步骤2：NC膜(3)的制备：检测线T线（4）和质控线C线（5）的制备：用缓冲液稀释待包被马铃薯病毒兔多隆抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将马铃薯病毒兔多克隆抗体划膜到距离金标垫1‑2cm处NC膜上，以0.5~1.5µL/cm的浓度划膜于NC膜（3）上，构成检测线T线（4）；用缓冲液稀释待包被马铃薯病毒羊抗兔抗体至0.5~1.5mg/mL浓度，用三维大平台划膜喷金仪将马铃薯病毒羊抗兔抗体划膜到距离吸水垫2‑3cm处NC膜（3）上，以0.5~1.5µL/cm的划膜浓度划膜于NC膜（3）上，构成质控线C线（5）；检测线T线（4）和质控线C线（5）距离4‑6mm；将划有检测线T线（4）和质控线C线（5）的NC膜(3) 置于35‑40℃条件下烘干，封装备用；缓冲液：缓冲液的作用是提供一定pH和离子强度使马铃薯病毒兔多克隆抗体和马铃薯病毒羊抗兔抗体牢固包被于NC膜（3）上，缓冲液的pH值为7.0~7.4；步骤3：样品垫(1)的制备：选用玻璃纤维膜做为制备样品垫(1)的材料，玻璃纤维膜经处理后方可使用；玻璃纤维膜的处理步骤：戴手套，将玻璃纤维膜放入处理液中，完全浸泡，浸泡5‑15min,后取出脱水3‑5min，平置在筛网上，放入35‑40℃干燥箱，烘干至湿度恒定在20‑30%，将烘干后的玻璃纤维膜装入铝箔袋热封保存；处理液的配方：pH7.8‑8.0磷酸缓冲液，0.5‑1.5%S9表面活性剂，0.4‑0.5%吐温20，0.5‑1.5%牛血清白蛋白，0.1‑0.3%聚乙烯吡咯烷酮，溶剂为水；步骤4：试纸条的组装：把步骤1 ~ 3所制作完成材料，根据PVC底板（7）的规格切割成一定的长度和宽度，粘贴PVC底板（7）上并安装在卡壳（8）里；试纸条的组装步骤：1）将NC膜（3）粘贴在PVC底板（7）上； 2）将金标垫（2）搭接在NC膜（3）一端的上方，搭接长度为1‑2mm； 3）将吸水垫（6）搭接在NC膜（3）另一端的上方，搭接长度为2‑3mm； 4）将样品垫（1）搭接在金标垫（2）的上方，搭接长度为2‑3mm； 5）在斩切机中将粘贴好的PVC底板（7）剪切成条；6）剪切成条后装壳并和干燥剂一并装入铝箔袋，密封后贴上标签。