[发明专利]一种玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法。具体步骤如下：取玉米种子50粒，用刀片将胚上方的种皮划开；用有效氯为1%的次氯酸钠消毒液进行种子消毒，备用；用基因工程的方法将扩增后的番茄PDS基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中；农杆菌转化及培养；配制转化菌液；玉米种子侵染。玉米基因组复杂，突变体不易获得，遗传转化困难且受基因型限制，本发明首创利用利用TRV、采用番茄PDS病毒基因对玉米种子进行病毒载体的侵染，进而实现玉米PDS基因沉默，本发明方法简便、快捷、高效、低成本、不需要基因转化，且本发明为全株沉默，效率高，方便研究目的基因在各个组织中功能。

主权项

一种玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤(1)：取玉米种子50粒，用刀片将胚上方的种皮划开；用有效氯为1％的次氯酸钠消毒液进行种子消毒，备用；步骤(2)：用基因工程的方法将扩增后的番茄八氢番茄红素脱氢酶(下称：番茄PDS)基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到pTRV‑SlPDS；步骤(3)农杆菌转化及培养：3.1)将pTRV‑SlPDS、pTRV2以及pTRV1质粒分别用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态细胞中，经菌液PCR鉴定正确后，得到分别含有质粒pTRV1、pTRV2和pTRV‑SlPDS的农杆菌GV3101阳性菌株，记为TRV1、TRV2和TRV‑SlPDS，保菌备用；3.2)将含有TRV1、TRV2、TRV‑SlPDS质粒的农杆菌GV3101菌液，在含有抗生素的LB平板培养基上培养长出单克隆；3.3)分别挑取3.2)中的单克隆放于含有抗生素的LB液体培养基培养，以实现单克隆的增殖；3.4)将3.3)得到的TRV1与TRV2单克隆培养液以1：1混合，TRV1与TRV‑SlPDS单克隆培养液以1:1混合，分别按1:100转接到相同的LB培养基上，在三角瓶中继续培养到菌液的O.D.600＝0.04‑1.5，并调整两个三角瓶中的菌液的O.D.600值相同；步骤(4)配制转化菌液：向步骤(3)所得的菌液中加入乙酰丁香酮、半胱氨酸和吐温20，均匀混合得到含TRV1与TRV2的转化菌液和含TRV1与TRV‑SlPDS的转化菌液，放置于超净工作台中备用；步骤(5)玉米种子侵染：含TRV1与TRV2的转化菌液和含TRV1与TRV‑SlPDS的转化菌液侵染步骤(1)处理过的玉米种子，继续培养，观察表型，提取RNA使用半定量RT‑PCR方法检测被沉默玉米中PDS基因转录本的沉默效果。