[发明专利]一种人类视网膜色素上皮细胞的分离、冻存方法

摘要

本发明涉及一种人类视网膜色素上皮细胞的分离、冻存方法，首先将视网膜色素上皮细胞进行培养液的清除并进行洗涤，然后将DispaseⅡ分离酶和DPBS缓冲液按1:40‑50w/v混合，制成DispaseⅡ分离酶溶液，DispaseⅡ分离酶溶液和Tryple select溶液按体积比为1:2‑3混合制成消化液进行消化分离，最后经过计数、离心后进行冻存。本发明分离方法简单，步骤易于控制，采用DispaseⅡ分离酶和Tryple select溶液混合制成消化液对视网膜色素上皮细胞进行消化分离，能够缩短视网膜色素上皮细胞解除贴壁的时间，同时保持细胞的完整性，对细胞的损伤大大降低。

主权项

一种人类视网膜色素上皮细胞的分离、冻存方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）清除培养液：将视网膜色素上皮细胞从二氧化碳培养箱中取出，吸去培养液；（2）洗涤：向培养瓶内加入DPBS（CTS）缓冲液5~10ml，轻轻摇匀，完全洗涤后移除液体；（3）消化：将DispaseⅡ分离酶和DPBS缓冲液按1:40‑50w/v混合，制成DispaseⅡ分离酶溶液，DispaseⅡ分离酶溶液和Tryple select溶液按体积比为1:2‑3混合制成消化液，向步骤（2）中的培养瓶中加入消化液2~3ml，充分混匀后放入二氧化碳培养箱中继续培养10~15min；（4）准备：在离心管中加入视网膜色素上皮细胞培养基3~5ml备用；（5）终止：将视网膜色素上皮细胞从二氧化碳培养箱中取出，加入2~3ml视网膜色素上皮细胞培养基终止反应，吹打细胞，将视网膜色素上皮细胞收集至准备好的离心管中；（6）计数：将视网膜色素上皮细胞混匀后取50~100ul细胞悬液进行细胞活率计数；（7）离心：将收集好的视网膜色素上皮以1800~2200 rpm/min离心，离心时间为5~10min；（8）冻存：离心结束后弃去上清，根据细胞计数结果加入冻存液Cryo‑SFM，调整细胞密度为1×106/ml，分装至冻存管中进行冻存。