[发明专利]由脐带间充质干细胞制备CD34阳性细胞的方法

摘要

本发明涉及由脐带间充质干细胞制备CD34阳性细胞的方法。具体包括如下步骤：(a)提供脐带来源的间充质干细胞；(b)对间充质干细胞进行原代培养；(c)对间充质干细胞进行传代培养；(d)在传代培养过程中，向培养基中加入诱导剂对间充质干细胞进行诱导；(e)获得CD34⁺细胞。还涉及包括该方法制得的CD34阳性细胞的细胞制品，以及它们的用途。本发明方法具有如说明书所述优异技术效果。

主权项

1.由脐带间充质干细胞制备CD34⁺细胞的方法，该方法包括如下步骤：(a)提供脐带来源的间充质干细胞；(b)对间充质干细胞进行原代培养；(c)对间充质干细胞进行传代培养；(d)在传代培养过程中，向培养基中加入诱导剂对间充质干细胞进行诱导；(e)获得CD34⁺细胞；该方法具体包括如下步骤：步骤1、人脐带样本的预处理在无菌条件下，用酒精对脐带组织表面进行消毒，将脐带从中间剪开；用含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS充分洗涤，去除残余血渍；将脐带等分为0.5cm的脐带段，仔细剔除动静脉后，取50mL离心管盛装脐带段，1段/离心管；在离心管中，将脐带段剪成大小为1mm×1mm×1mm的碎片，剪碎过程中滴加LG‑DMEM培养液保持组织湿润；用含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS缓冲液洗涤2次后备用；所述PBS缓冲液是pH7.2、磷酸根浓度0.025M的磷酸钠缓冲液；步骤2、酶解将步骤1中获得的脐带碎片，用混合酶液在37℃下消化2h；混合酶液包含：0.1％Ⅰ型胶原酶、0.1％胰酶、0.1％透明质酸酶、0.1％DNA酶、0.02％EDTA；消化后，以离心力400g，温度4±2℃，离心15分钟；弃去混合酶液，获得脐带来源的单个细胞；步骤3、细胞的原代培养将步骤2处理所得的细胞，按1×10⁶细胞/ml的密度，接种到T‑25培养瓶中，在20ml补充有体积/体积百分数10％的胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于37℃、体积/体积百分数5％的CO₂、95％湿度的培养箱中孵育培养3天；3天后第1次换液，去除未贴壁的细胞；以后每48h更换培养液；步骤4、细胞的传代培养倒置显微镜下观察细胞的形态，待细胞长满至培养瓶底的80％左右，弃去培养液；用pH7.2的PBS漂洗1次后，加0.25％胰蛋白酶‑EDTA，在37℃下消化2min；轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后加入含体积/体积百分数10％的人AB血浆的RPMI1640培养液终止消化；收集吹打后所得细胞，以1000g离心10min，弃上清；用含体积/体积百分数10％的人AB血浆的RPMI1640培养液重悬，按照1∶2的比例进行传代接种，置于37℃、体积/体积百分数5％的CO₂、95％湿度的培养箱中孵育培养；每2天更换培养液1次；待细胞增殖并覆盖瓶底80％左右时，用同样方法传代，传代4次后，获得P5代细胞；步骤5、诱导条件下的传代培养倒置显微镜下观察P5代细胞的形态，待长满至培养瓶底的80％左右，弃去培养液；用pH7.2的PBS漂洗1次后，加0.25％胰蛋白酶‑EDTA，在37℃下消化2min；轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后加入含体积/体积百分数10％的人AB血浆的RPMI1640培养液终止消化；收集吹打后所得细胞，以1000g离心10min，弃上清；用含体积/体积百分数10％的人AB血浆和0.1μmol/L CD34抗体、0.1μmol/L己二酸二钠、重量/体积百分数0.25％的麦芽糖的RPMI1640培养液重悬，按照1∶3的比例进行传代接种，置于37℃、体积/体积百分数5％的CO₂、95％湿度的培养箱中孵育培养；所述CD34抗体是鼠抗人CD34单克隆抗体；每24小时更换培养液1次；待细胞增殖并覆盖瓶底80％左右时，完成一次传代；将该代细胞用同样方法继续传代，最多可以传代15次；步骤6、CD34⁺细胞的收集待传代培养的细胞增殖并覆盖瓶底80％左右时，弃去培养液；用pH7.2的PBS漂洗1次后，加0.25％胰蛋白酶‑EDTA，在37℃下消化2min；轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后终止消化；吹打后所得细胞以1000g离心10min，弃上清；收集CD34⁺细胞，即得。