[发明专利]脐带间充质干细胞培养上清4℃保护方法

摘要

本发明涉及一种脐带间充质干细胞培养上清4℃保护方法，首先取足月脐带，鉴定后可用；再进行培养、饥饿培养，制备上清，再加入保护剂进行，最后进行冷藏。本发明提供的脐带间充质干细胞培养上清4℃保护方法确保4℃存放15天后，干细胞上清中的蛋白含量不变化，延长干细胞培养上清4℃的存放时间，可以大大降低干细胞培养上清的运输成本。

主权项

一种脐带间充质干细胞培养上清4℃保护方法，其特征在于：步骤如下：⑴取足月健康胎儿脐带，用胶体金、荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗‑HCV，HCV‑RNA,抗‑HDV，抗HEV，抗‑HIV‑1/2，HIV‑1‑RNA,CMV‑DNA，检测结果均为阴性的脐带方可使用；⑵将脐带置于无菌平皿中，用无菌手术剪剪成5cm的小段，用PBS反复清洗残留在血管内的血液，直至清洗后的PBS基本无色为止；⑶将清洗后的脐带转移到弯盘中，剥离脐静脉和脐动脉后，用手术剪将脐带沃顿胶剪切成1‑5mm的小块，均匀平铺到T75培养瓶底部；⑷将平铺好脐带组织块的培养瓶放入二氧化碳培养箱内，干燥30分钟；⑸往培养瓶中缓慢加入含10％胎牛血清和血清白蛋白添加物的培养基，培养基的用量以刚刚浸没组织块为宜；⑹每6天换液1次，观察组织贴块边缘细胞生长情况，待大多数组织块细胞爬出且每个块组织块周围的细胞生长至80％左右融合时，进行脐带间充质干细胞的原代传代；⑺按8000cells/cm2的密度接种P4代脐带间充质干细胞细胞于T75培养瓶中，加入10ml DF12完全培养基；⑻待细胞长至80％融合时，用5mL PBS缓冲液冲洗细胞表面3次；⑼吸尽PBS缓冲液，加入10mL DF12培养基饥饿培养72小时；⑽收集饥饿培养72小时后的脐带间充质干细胞培养上清，将上清收集到50mL离心管内300g，室温离心5分钟；⑾弃沉淀，收集干细胞培养上清液，用5KD的透析袋对干细胞上清进行浓缩，浓缩10倍，获取含有5KD以上分子量的有效干细胞分泌混合因子；⑿在浓缩后的干细胞培养上清中加入10体积比％甘油或10％g/ml的甘露醇，作为干细胞培养上清保护剂，以不添加保护剂的干细胞培养上清作为对照，放入4℃冰箱保存。