[发明专利]一种大量提取细菌质粒的方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种快速、简便、大量提取细菌质粒的方法。该方法包括筛选获得含有质粒的原核细胞、玻璃珠悬起菌落、裂解细胞、提取质粒等步骤。本申请通过对细菌中质粒提取操作流程的优化，结果表明，利用玻璃珠悬起菌落并快速提取质粒的方法在原核表达系统中具有较好的应用效果，可较为快速的获得大量质粒，为转基因、BAC文库构建、细胞转染等应用研究奠定基础。由于该方法不需大量摇菌培养，操作较为方便，因而操作成本较为低廉；同时由于不需要大型的高速低温离心机的使用，且能够较为快速的大量提取质粒，因而对于缩短实验时间，提高实验效率具有较好地应用价值。

主权项

一种大量提取细菌质粒的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）筛选获得含有质粒的原核细胞，具体为：首先，在将目的质粒转化原核细胞后，挑取含有质粒的原核细胞的单菌落接种于含有抗性抗生素的液体培养基中，进行扩大培养；其次，吸取扩大培养后的菌液涂布于含有抗性抗生素的固体培养基的平板上，培养过夜；最后，在平板上加入无菌水和灭菌的玻璃珠摇晃，利用玻璃珠悬起菌落；待培养基中无菌落残留时，将含有菌落的无菌水吸出，置于离心管中，离心弃上清，保留沉淀，即为含有质粒的原核细胞；（2）裂解细胞，具体为：向步骤（1）中离心后沉淀中加入溶液I，震荡重悬菌体，静置3~5min；然后加入溶液II ，混匀后，冰上放置3~5min；再加入溶液III，混合均匀，并冰上放置3~5min；所述溶液I，每升溶液中的组份为：1M Tris‑HCL、50mL，0.5M EDTA、20mL，其余为ddH2O，pH=7.5，灭菌；所述溶液II，每升溶液的配制方法为：0.4M 的NaOH的ddH2O溶液与质量浓度2%的SDS的ddH2O溶液的等体积混合液；所述溶液III，每升溶液的制备方法为：在600mL的ddH2O中依次加入129.69g的KAc和100mL冰乙酸，溶解并混合均匀后，乙酸调节pH=4.8，然后用ddH2O定容至1L；（3）提取质粒，具体为：将步骤（2）中冰上放置后的溶液离心，弃沉淀，取上清液于离心管中，加入氯仿‑异戊醇混合液，混合均匀，放置15~25min；将放置后混合液离心，取上清液置于预先加有无水乙醇的离心管中，离心，弃上清，再用乙醇漂洗沉淀后，即为所提取的质粒。