[发明专利]鉴别三种药用石斛及其相似种的ISSR指纹图谱方法

摘要

本发明公开了一种鉴别三种药用石斛及其相似种的ISSR指纹图谱方法，包括以下步骤样品预处理，DNA初步提取，DNA的检测及保存，ISSR‑PCR反应，电泳检测及基因分型能力评估，ISSR‑PCR指纹图谱的建立，未知种属的石斛样品种类的鉴定。本发明的优点在于利用ISSR‑PCR技术对安徽霍山产三种药用石斛及其相似种进行种间和种下鉴别，建立了一个完整可靠的药用石斛ISSR—PCR反应系统(反应体系、反应程序和扩增引物)和分子标记指纹图谱，为研究药用石斛的鉴别和良种选育、提供分子水平上的参考和借鉴。

主权项

一种鉴别三种药用石斛及其相似种的ISSR指纹图谱方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)：样品预处理将采集到的药用石斛材料用70％‑75％的乙醇水溶液擦拭表面后，按同种类混合在一起，取8‑12g，加入10‑12mL DNA提取缓冲液，放在提前预冷至(‑25)‑(‑20)℃的研钵中，用研棒将其研磨成糊状，再用移液枪吸180‑200uL至离心管中；(2)：DNA初步提取①快速向上述离心管中加入400‑500uL提前预热至60‑65℃的DNA提取缓冲液，上下摇动混匀，60‑65℃水浴1‑1.5h后取出离心管，10000‑12000r/min离心10‑15min；②取上清液，加入等体积的氯仿与异戊醇混合液，上下颠倒离心管25‑35次，10000‑12000r/min离心10‑15min，取上清液，再用氯仿与异戊醇混合液处理1‑2次，10000‑12000r/min离心；③取上清液0.8‑1mL到离心管中，加入0.4‑0.6mL提前预冷至(‑25)‑(‑20)℃的异丙醇并混匀，静置10‑15min，10000‑12000r/min离心10‑15min，弃上清，沉淀分别用70％‑75％乙醇、无水乙醇各洗2‑3次，60℃‑65℃挥干乙醇5‑6min，此沉淀即为基因组DNA初提物，最后，加100‑150ul灭菌蒸馏水溶解DNA，即获得DNA提取液；(3)：DNA的检测及保存在得到DNA提取液后，对其纯度、浓度、完整性分别进行相应的检测及记录，再将检测完成的对应DNA提取液进行分管低温保存待用；(4)：ISSR‑PCR反应①ISSR‑PCR反应体系：模板10ng/L，引物0.3μM，Mg2+2.0mM，dNTP 200μM，Taq聚合酶1U/20μl；②ISSR‑PCR反应：以获取的DNA作为ISSR‑PCR反应的模板，在PCR仪上进行ISSR‑PCR扩增反应；第一阶段：反应体系中加入第一组引物，94℃预变性8min，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸2min，扩增10个循环；第二阶段：在上述反应体系中加入第二组引物，94℃变性45s，58‑50℃退火45s，72℃延伸2min，扩增25个循环，梯度退火，最后于72℃终延伸8min；(5)：电泳检测及基因分型能力评估取3‑5μl扩增产物用1.0％‑1.5％琼脂糖凝胶，5‑10V/cm恒压电泳检测，溴化乙锭染色后用凝胶成像系统对电泳检测结果进行拍照，获取相应电泳检测结果图，并对引物的基因分型能力进行评估分析，根据基因分型能力评估分析结果，确定该电泳检测结果是否可有效区分全部样品；(6)：ISSR‑PCR指纹图谱的建立当基因分型能力评估结果显示电泳检测结果可有效区分全部样品后，该电泳检测结果图即为所选择鉴别的不同种药用石斛的ISSR‑PCR指纹图谱；(7)：未知种属的石斛样品种类的鉴定把未知种属的石斛样品按照上述步骤(1)‑(6)建立其相应的ISSR‑PCR指纹图谱，再将其与已建立的已知种属的药用石斛的ISSR‑PCR指纹图谱的信息相比较，当其与某一泳道的条带信息的吻合度达98％以上，即可判定为同一种；当其与某一泳道的条带信息的吻合度介于95％‑98％之间，则可确定为近似种；当其与所有条带的吻合度都低于95％，即可判定不属于已知的任何一种药用石斛种类。