[发明专利]基于核酸适配体的大肠杆菌O157：H7胶体金试纸条及检测方法

摘要

本发明提供一种基于核酸适配体的大肠杆菌O157：H7胶体金试纸条，包括样品垫、胶体金结合垫、固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜和吸收垫，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘贴在塑料衬板上；所述胶体金结合垫上有胶体金标记的核酸适配体，所述检测线固定有捕获探针，所述质控线固定有质控探针。本发明还提供利用所述胶体金试纸条检测大肠杆菌O157：H7的方法。本发明用大肠杆菌O157：H7外膜蛋白高特异性适配体代替抗体作为试纸条的识别元件，克服了免疫层析试纸条所用抗体成本高、批次差异大、存在交叉反应，灵敏度不高等缺点，可以实现大肠杆菌高效快速检测。

主权项

1.利用基于核酸适配体的胶体金试纸条检测大肠杆菌O157：H7的方法，其特征在于，包括样品增菌培养、试纸条检测及结果判读的步骤；具体方法如下：(1)称取23.5g脑心浸液肉汤培养基，加入预热至42±1℃无菌水1L，溶解备用；(2)无菌操作取25g或25mL样品到均质袋中，并向其中加入225mL预热后的脑心浸液肉汤培养基，放入均质器中均质2min，42℃静置或振荡培养8h；(3)将(2)所得培养物混匀，取1mL加入到试管中，100℃加热5min，冷却至室温，用滴管滴加3‑4滴至试纸条的样品垫上，反应5‑8min，判读结果，超过30min显色无效；(4)结果判读：阴性反应：质控线、检测线均显色；阳性反应：质控线显色，检测线不显色；失效反应：若质控线不显色，则检测失败或试纸条失效；所述基于核酸适配体的胶体金试纸条，包括样品垫(1)、胶体金结合垫(2)、固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜(3)和吸收垫(4)，所述固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜(3)上设有检测线(5)和质控线(6)，所述样品垫(1)、胶体金结合垫(2)、固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4)依次粘贴在塑料衬板(7)上；所述胶体金结合垫(2)固定有胶体金标记的核酸适配体，所述检测线(5)固定有捕获探针，所述质控线(6)固定有质控探针；所述捕获探针为：5’‑ATACGGGAGCCAACACCATAATATGCCGTAAGGAGAGGCCTGTTGGGAGCGCCGTAGAGCAGGTGTGACGGAT‑biotin‑3’；所述质控探针为：5’‑AAAAAAAAAAAA‑biotin‑3’；所述核酸适配体的核苷酸序列为5’‑polyT‑ATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCCTCTCCTTACGGCATATTATGGTGTTGGCTCCCGTAT‑3’；所述polyT序列为：TTTTTTTTTTTT；所述胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：S1、金纳米颗粒的制备；S2、金纳米颗粒‑核酸适配体复合物的制备；S3、检测线和质控线的制备；S4、胶体金试纸条的组装；S1具体为：取1％的HAuCl4水溶液1mL，加入99mL蒸馏水，加热沸腾，迅速向其中加入浓度为1％的柠檬酸钠5mL，搅拌，加热15min后停止加热，并继续搅拌至室温，得到的Au NPs原液中含有粒径为15±2nm的金纳米颗粒，4℃避光保存；S2包括以下步骤：S21、取6μL 100μM巯基适配体溶液，加入6μL 5mg/mL的盐酸三(2‑羧乙基)膦溶液，4℃活化2h；S22、取Au NPs原液5mL以13000rpm离心15min，除去上清液并加入5mL水复溶，然后向其中加入活化后的巯基适配体，混匀，在室温下反应16h；接着，加入50μL 1％的十二烷基硫酸钠溶液至终浓度为0.01％，在室温下反应1h；然后，分多次加入2mol/L NaCl溶液共80μL至盐离子终浓度为160mM，继续在室温下反应24h；S23、将S22中得到的溶液以13000rpm离心15min除去未反应的巯基适配体，并用水清洗一次，溶解在缓冲液中，4℃避光保存，即得胶体金标记的核酸适配体固定液，固定液中含有所述金纳米颗粒‑核酸适配体复合物；其中，S23中所述缓冲液为含有0.5％PEG，2％蔗糖，0.1％吐温‑20，0.02％硫酸镁，0.05％硫酸铵和1％卵清蛋白的pH 7.4，10mM的磷酸缓冲液；S3包括以下步骤：S31、生物素标记的捕获探针的制备；S32、生物素标记的质控探针的制备；S33、检测线和质控线的制备：将10‑35μL 1mg/mL的亲和素溶液分别与10‑35μL 10μM生物素标记的捕获探针及质控探针在4℃孵育2h，利用划膜仪滴加在固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜上分别得到检测线和质控线；S4具体为：将所述样品垫、胶体金结合垫、固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘贴在塑料衬板上；将所述固定液以5μL每条的量滴加在胶体金结合垫上，在室温下风干5min，4℃避光保存，即得所述胶体金试纸条。