[发明专利]一种检测叶酸代谢关键酶基因多态性位点基因分型试剂盒和其检测方法

摘要

本发明提供一种利用荧光标记探针结合多重PCR方法对叶酸代谢关键酶基因(MTHFR和MTRR)3个位点进行分型的方法。根据MTHFR和MTRR基因设计扩增引物和荧光探针，在PCR仪扩增中待测三段DNA序列，检测反应体系中的扩增和溶解过程中释放的荧光信号，结果判读通过：(1)根据野生型和突变型标准质粒的杂交峰所显示的Tm值为来判断分型结果；(2)同时又可以通过扩增曲线的荧光值高低分型。本发明使用的引物和探针特异性强，灵敏度高；三个位点的检测同时进行，操作简单，结果容易判读；两次校准的分型方式使得分型结果更加准确可靠。本发明所述方法可在指导孕妇口服补充叶酸、提示脑卒中、冠心病和静脉血栓的高风险性以及叶酸代谢活性评估等方面进行应用。

主权项

1.一种用于MTHFR、MTRR基因型分型检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：（1）用于扩增样本DNA中MTHFR、MTRR编码基因上3个SNP位点rs1801131， rs1801133和rs1801394的相应的PCR引物对，所述样本为血液、组织、体液；所述PCR引物对的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO.4：MTHFR rs1801131F： CTACCTGAAGAGCAAGTCCC，SEQ ID NO.5：MTHFR rs1801131R： CACTCCAGCATCACTCACTT，SEQ ID NO.6：MTHFR rs1801133F： GAAGCACTTGAAGGAGAAGG，SEQ ID NO.7：MTHFR rs1801133R： GTGCATGCCTTCACAAAGCG，SEQ ID NO.8：MTRR rs1801394F： TGCCTTGAAGTGATGAGGAG，和SEQ ID NO.9：MTRR rs1801394R： AATCCATGTACCACAGCTTG；（2）3条分别特异性结合由3组引物对扩增的目的片段的荧光探针；所述荧光探针的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO.10：MTHFR rs1801131‑probe： 5’‑CTGACCAGTGAAGcAAGTGTCTTTGggtcag ‑3’，SEQ ID NO.11：MTHFR rs1801133‑probe：5’‑ccggATGATGAAATCGaCTCCCGtccgg ‑3’，和SEQ ID NO.12：MTRR rs1801394‑probe：5’‑cgCGCAGAAGAAATaTGTGAGCAAcgcg ‑3’；（3）必要的核酸扩增和杂交试剂：包括双蒸水，dNTPs，3对PCR引物混合液，3条荧光标记探针，TaqDNA聚合酶，Mg²⁺，PCR反应缓冲液，已知3个SNP位点rs1801131， rs1801133和rs1801394野生型和突变型的标准质粒。