[发明专利]一种利用石蒜小鳞茎快繁培养产生加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的方法

摘要

本发明提供了一种用中国石蒜小鳞茎组织培养产生加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的方法，以‘中国石蒜’鳞茎为外植体，经灭菌、接种，培养一段时间后，在鳞片伤口处产生小鳞茎，继续对小鳞茎进行增殖培养。取中国石蒜小鳞茎组织烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次，得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液。本发明应用组织培养技术克服石蒜属植物资源紧张，加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏化学合成复杂的问题。所用基本培养基以SH培养基为基础，辅以6‑苄氨基腺嘌呤、α‑萘乙酸、酵母提取物等成分；为进行工厂化生产加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏提供基础，环境友好，原料丰富，可很好缓解市场对加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏供应缺口大的问题。

主权项

1.一种利用‘中国石蒜’小鳞茎快繁培养产生加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的方法，其特征是，包括下列步骤：A、外植体的选择和灭菌处理：以‘中国石蒜’鳞茎为外植体，2%～3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗，摇床，再用清水冲洗，经75%酒精杀毒，0.1 %氯化汞灭菌处理，无菌水冲洗，备用；B、外植体接种：将经过步骤A中准备的外植体，接种在6‑BA 5.0 mg/L和0.5 mg/L NAA，2，4‑D2.0 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8‑5.95；每天光照8 h，黑暗16 h；C、小鳞茎的诱导：将经过步骤B中得到的外植体，培养于6‑BA 5.0 mg/L和1.0mg/L NAA的SH培养基中，其中蔗糖40‑60g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.80‑5.95，每天光照12 h，黑暗12 h，至出现‘中国石蒜’小鳞茎；D、小鳞茎培养：将步骤C中得到的‘中国石蒜’小鳞茎接种于SH+6‑BA 5.0 mg/L+0.5mg/L NAA +酵母诱导物0.1g/L的培养基中，其中蔗糖60‑90g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.80‑5.95，每天光照12 h，黑暗12 h，培养10‑15天后检测小鳞茎中加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏含量；酵母诱导物制作方法：精确称量25 g的酵母提取物 (yeast extract) ，加入125 ml 蒸馏水，然后加入100 ml 乙醇，放入4 ℃冰箱提取4 d，弃去上清液，把剩余的粘稠沉淀物再次溶解于125 ml蒸馏水中再次进行乙醇提取，用100 ml的蒸馏水溶解最终的沉淀物，在高压灭菌锅中121 ℃灭菌2 h贮存于4 ℃冰箱中备用；酵母诱导物的浓度用总的碳水化合物含量来表示，以蔗糖为标准品采用苯酚‑硫酸比色法确定其浓度；E、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏提取：将步骤D中的小鳞茎烘干、研磨并用甲醇超声萃取3次，超声处理时间为25‑35min，得到含有加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的甲醇溶液，用0.45μm滤膜过滤，定容至10mL备用；F、加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏检测：经HPLC检测，‘中国石蒜’小鳞茎中含有加兰他敏、石蒜碱和力可拉敏，平均含量为26.51、15.91和63.67 μg/g 干重；色谱条件为：Kromasil C18柱 ：5 µm，150mm×46mm ；以乙腈—水相为流动相；其中乙腈与水相的比为20：80，每800 ml水相中含有2.67 ml二丁胺，用磷酸调节pH为9．0±0．05；流速1.0 m1/min；检测波长：289 nm；柱温：室温；进样量：10µl。