[发明专利]羊肉及其制品掺假鼠肉的鉴定方法

摘要

本发明涉及羊肉及其制品掺假鼠肉的鉴定方法，可有效解决羊肉及其制品中是否掺有鼠肉，确保羊肉质量的问题，方法是，熟羊肉及其制品用分别用乙醇、乙醚洗涤2次；分别称取鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品各加入蛋白提取液混悬，冰浴，离心，蛋白加入二硫代苏糖醇溶液反应，然后加入碘乙酰胺溶液反应；再加入冰丙酮，放置，离心，沉淀碳酸氢铵溶液复溶，加入胰蛋白酶混匀酶切，加入甲酸终止反应，再分别净化、除盐，用HPLC‑Q/Exactive测定肉中的多肽化合物；Sieve 2.0和Maxquant 1.5.3.8软件分析，选取每个物种中的多肽信息，去掉含有Miss Cleavage的多肽，获得相对特异性多肽，本发明方法独特，科学、先进，易操作，方法稳定可靠，准确率高，应用面广，实用性强。

主权项

一种羊肉及其制品掺假鼠肉的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、肉样品的预处理：鲜生羊肉及鲜生鼠肉直接进行肉蛋白的提取和酶切；熟羊肉及其制品用质量浓度95％乙醇洗2次，再用乙醚洗2次，室温下蒸发干溶剂，得处理后的熟羊肉及其制品，进行肉蛋白的提取和酶切；每2g熟羊肉及其制品每次质量浓度95％乙醇用量为20mL，每次乙醚用量为10mL；(2)、肉蛋白的提取和酶切：分别称取鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品各100mg，各加入1000μL蛋白提取液混悬，冰浴10min，在4℃、13000r/min离心10min，取上清液测蛋白浓度，分别取0.5mg蛋白加入1M的二硫代苏糖醇溶液使浓度保持在10mM，在56℃下反应40min，然后各加入0.5M的碘乙酰胺溶液使浓度保持在50mM，避光反应40min；再各加入4倍体积的‑20℃冰箱预冷过夜的丙酮，‑20℃放置5h，离心，弃上清液，再每次用1mL冰丙酮洗两遍，最后各用200μL碳酸氢铵溶液复溶，按重量体积比20︰1加入胰蛋白酶混匀，重量体积是指固体以g计，液体以mL计，酶切过夜，酶切后的样品各加入2μL甲酸终止反应，得鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品的含多肽化合物溶液；(3)、鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品的含多肽化合物溶液的分别净化、除盐：将鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品用的萃取HLB柱先依次用3mL甲醇、3mL水活化，再将鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品的含多肽化合物溶液分别装入HLB柱中，待含多肽化合物溶液全部流出后用3mL水淋洗，使柱体保持抽干5min，5mL甲醇洗脱，收集各自的洗脱液，于氮气流下浓缩至干，加入乙腈和质量浓度0.1％甲酸溶液溶解残渣，分别得到净化后的多肽化合物溶液，经0.2μm滤膜过滤，HPLC‑Q/Exactive测定肉中的多肽化合物；(4)、用HPLC‑Q/Exactive仪测定肉中的多肽化合物：用HPLC‑Q/Exactive仪，在色谱、质谱条件下，先找到纯的生鲜羊肉和鼠肉找到各自的特征多肽，由于经过加热加工的肉中不稳定的特征多肽会降解，因此通过测定寻找经过加工处理的熟羊肉及羊肉制品和熟鼠肉中稳定存在的特征多肽各4条，见下表：作为定性的依据，然后通过测定不同比例的鼠肉掺到羊肉中，对掺假羊肉进行测定；(5)、数据分析：对上述用HPLC‑Q/Exactive获得的数据，同时采用Sieve 2.0和Maxquant 1.5.3.8软件进行分析，方法是：Sieve2.0数据分析：将羊肉设为参比组，鼠肉设为对照组，设定目标为蛋白组学差异性分析，质量准确度阈值设为10ppm，进行Align和Frame分析；Maxquant 1.5.3.8分析：肉类样品进行非标记定量(LFQ)分析，检索数据库为羊、鼠物种的Uniprot全库，最多漏切位点设为2，可变修饰为氧化蛋氨酸、乙酰化N‑端，固定修饰为脲甲基修饰半胱氨酸，勾选异亮氨酸等于亮氨酸设置(I＝L)，为获得尽可能多的多肽定量信息，选择所有定量肽段信息选项，其他参数为Maxquant默认值；利用非标记定量的结果，选取每个物种中独有的多肽信息，去掉含有Miss Cleavage的多肽，获得相对特异性多肽，从而实现对羊肉掺假鼠肉的鉴定。