[发明专利]卵母细胞表达mCherry蛋白斑马鱼家系构建方法

摘要

卵母细胞表达mCherry蛋白斑马鱼家系构建方法，涉及斑马鱼。包括以下步骤1)zpc启动子的克隆；2)pminiTol2‑zpc‑mCherry表达载体的构建；3)体外合成Tol2转座酶加帽mRNA；4)mCherry转基因斑马鱼家系的建立。首先采用PCR的方法，从斑马鱼基因组中得到了zpc基因的启动区序列，再利用pminiTol2‑Mlc2f‑mCherry载体，进而构建pminiTol2‑zpc‑mCherry转基因表达载体，最后通过对斑马鱼胚胎进行显微注射的方法，构建了一个卵母细胞特异表达mCherry荧光蛋白的转基因斑马鱼家系。

主权项

卵母细胞表达mCherry蛋白斑马鱼家系构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)zpc启动子的克隆，具体方法如下：取20mg新鲜斑马鱼肌肉，按海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的方法提取基因组DNA；根据NCBI上已报道的斑马鱼zpc启动子基因序列，设计一对引入酶切位点的特异引物：Zpc0.5:RFP‑fw2：5’‑GTGGCTAAGCAAAATCCCCATGACATGCTGC‑3’(下划线部分为BlpI酶切位点)；Zpc0.5:RFP‑rv1：5’‑GCGGGATCCATTGCCTGCTGACTAATTAAACC‑3’(下划线部分为BamHI酶切位点)；以斑马鱼基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增片段经切胶回收后进行TA克隆连入pMD19T(Simple)质粒，氨苄青霉素筛选，得到pMD19T‑zpc单克隆，摇菌，提取质粒，测序鉴定；2)pminiTol2‑zpc‑mCherry表达载体的构建，具体方法如下：用限制性内切酶BlpI/BamHI双酶切pMD19T‑zpc，切胶回收带有酶切位点的zpc启动子片段；用限制性内切酶HindIII/BamHI双酶切pminiTol2‑Mlc2f‑mCherry质粒，切胶回收pminiTol2‑mCherry骨架，再将zpc启动子片段连接到pminiTol2‑mCherry骨架、测序鉴定得到pminiTol2‑zpc‑mCherry质粒；3)体外合成Tol2转座酶加帽mRNA，具体方法如下：用限制性内切酶BamHI酶切pT3TS‑Tol2质粒，切胶回收得到线性片段，然后使用mMESSAGE试剂盒进行体外转录得到Tol2转座酶加帽mRNA，Nanodrop 2000测定浓度；4)mCherry转基因斑马鱼家系的建立，具体方法如下：产卵前一天性成熟雌雄鱼以1︰(1～2)比例配对，放在同一繁殖缸中并用隔板隔开，第二天08:00拿掉隔板进行配对产卵；收集发育到1～2细胞期的胚胎后，将含有质粒pminiTol2‑zpc‑mCherry和Tol2转座酶加帽mRNA的液体注射到受精卵中，注射后的受精卵放在E3培养液中培养；孵化后转至鱼房继续培养，在注射后于荧光显微镜下观察筛选具有mCherry荧光信号的胚胎个体，作为zpc‑mCherry转基因鱼F0代进行孵化培养，F0代鱼性成熟后与野生型斑马鱼配对，从而筛选出可传代F1代杂合个体，并将其培养至性成熟后再进行同质配对，最终获得卵母细胞稳定表达mCherry荧光蛋白的转基因斑马鱼家系。