[发明专利]一种Ad5‑M2m作为通用流感疫苗毒种的构建与制备方法

摘要

本发明公开了一种Ad5‑M2m作为通用流感疫苗毒种的构建与制备方法，制备Ad5‑M2m重组腺病毒作为通用流感疫苗毒种，步骤包括携带多个流感亚型保守性免疫原M2m重组腺病毒载体的构建及毒种的建立；Ad5‑M2m接种与培养；Ad5‑M2m的收获；Ad5‑M2m初步免疫等；依据本发明方法制备的Ad5‑M2m作为通用流感疫苗具有抗原谱广、质量稳定、纯度高、安全性好、成本低等方面优点，适合于大规模生产，具有较大的应用价值。

主权项

一种Ad5‑M2m作为通用流感疫苗毒种的构建与制备方法，通过对流感病毒保守抗原M2的修饰、串联与优化，以及构建Ad5‑M2m实现，其特征在于，包括以下步骤：1)流感病毒主要保守性免疫原M2的修饰、串联与优化：对来自于H1N1、H3N2、H5N1亚型流感病毒的M2全长序列进行比较分析和抗原位点预测分析，位点的改造与修饰，经过串联和密码子优化后，形成串联的M2m基因，交由试剂公司合成基因序列，通过基因重组技术构建携带串联M2m基因的重组腺病毒Ad5‑M2m；然后通过PCR、测序方法，确定Ad5‑M2m构建成功与否；2)Ad5‑M2m的构建：设计酶切位点，在5’端引入Kpn I酶切位点，在3’端引入Xho I酶切位点，PCR扩增出M2m片段、1％琼脂糖凝胶电泳回收后，用Kpn I和Xho I进行酶切，与pGA1载体连接后转化Top10感受态，质粒小量扩增，PCR鉴定，测序正确后用BstZ17I和SgrA I酶切，并与pAd5进行连接转化，最后用Pac I酶切线性化重组腺病毒质粒并转染至293细胞中，拯救成功后进行扩增，标记为：Ad5‑M2m；3)Ad5‑M2m毒种的拯救：酶切线性化重组腺病毒质粒，并转染至293细胞，定期观察有无细胞病变出现，在10±2天收集原代病毒液，反复冻融后传代；第2代以后的重组腺病毒感染293细胞后出现明显的病变，具体为细胞皱缩、变圆、脱落和死亡；传第3代病毒液感染293细胞，48h后收集细胞，经Western Blot鉴定M2m是否正确表达，建立Ad5‑M2m重组腺病毒作为通用流感疫苗的毒种；4)Ad5‑M2m毒种的鉴定与培养：向细胞培养瓶中加入293细胞进行培养，将细胞裂解液上清加入DMEM混匀，从培养瓶中移去培养液，加入混合液感染细胞，十字形缓慢晃动3次，混匀，37℃培养60‑120min，加入DMEM，再培养48‑72h；进行MOI测定以测算病毒滴度；收集病毒颗粒的方法为，先收集被感染细胞，然后重悬在DMEM中，‑20℃/37℃反复冻融3次，离心沉淀细胞碎片；病毒颗粒收集完成后进行病毒滴度测定或者病毒纯化；5)Ad5‑M2m病毒的纯化：用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒颗粒；6)Ad5‑M2m半成品的配制：根据所配制的半成品总量计算原液用量，用专用稀释液进行稀释，使Ad5‑M2m达到1010vp/mL，即配制成Ad5‑M2m通用流感疫苗的半成品。