[发明专利]发酵乳杆菌快速溯源方法、用于所述方法的联合序列及其构建方法

摘要

本发明提供含有发酵乳杆菌基因组的联合基因序列在发酵乳杆菌溯源中的应用，所述联合基因序列包括dnaA、pyrG、rpoB、recA、dnaK和murC共6个看家基因。本发明还提供发酵乳杆菌快速溯源方法包括(1)提取发酵乳杆菌的基因组DNA；(2)各菌株的联合基因序列；(3)采用MEGA6.0软件，对各联合基因序列构建邻接法系统发育树，通过发育树获得发酵乳杆菌菌株的溯源分析；(4)将在系统发育树中处于同一分支的菌株判断为同一来源。本发明的方法能够有效、快速分离不同来源菌株，实现发酵乳杆菌的溯源，明确不同来源地的发酵乳杆菌的发育树关系。

主权项

1.含有发酵乳杆菌基因组的联合基因序列在发酵乳杆菌溯源中的应用，所述联合基因序列为dnaA、pyrG、rpoB、recA、dnaK和murC共6个看家基因；所述的联合基因序列的构建方法包括以下步骤：(1)根据发酵乳杆菌的看家基因dnaA、pyrG、rpoB、recA、dnaK和murC分别设计特异性扩增引物；(2)利用步骤(1)的引物分别通过PCR扩增发酵乳杆菌模板DNA，分别得到各看家基因片段，扩增体系：PCRmix 10μl，含有5U/μL Taq酶0.08μl；10×PCRbuffer 1μl Mg2+free；2.5mmol/L dNTPs 0.8μL，25mmo1/L Mg2+0.8μL，上下游引物各0.4μL，DNA模板1μl 10‑50ng/μl，ddH2O 5.52μL；扩增条件：95℃变性5min；循环30次：95℃变性1min，50℃退火45s，72℃延伸1min，然后72℃延伸10min，4℃保存；(3)核苷酸序列测定扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格，按照ABI 3730XL测序平台技术流程进行双向测序；(4)拼接序列将测序所得的双向序列导入软件DNAstar的Seqman模块中，结合序列峰图进行序列比对拼接及单碱基校对；然后采用6.0软件包分析，经Clustal W比对，并按照dnaA‑pyrG‑rpoB‑recA‑dnaK‑murC顺序拼接得到所述联合基因序列。