[发明专利]一种新疆野苹果miR156表达量的检测方法

摘要

本发明涉及一种新疆野苹果miR156表达量的检测方法，步骤如下(一)总RNA提取；(二)反转录；(三)qRT‑PCR检测；(四)对qRT‑PCR获得的数据进行法分析，在excel表中作柱状图，得到目的基因新疆野苹果miR156的相对表达量。本方法为首次对新疆野苹果小RNA提取的新方法，该方法可以为检测木本植物小RNA表达情况提供参考，对研究营养生长和生殖生长时相转变调控网具有参考意义，同时，也可以为后期新疆野苹果杂交育种、遗传改良实践提供理论依据。

主权项

一种新疆野苹果miR156表达量的检测方法，其特征在于：步骤如下：(一)总RNA提取总RNA采用CTAB法提取，具体步骤如下：⑴取不同树龄的新疆野苹果的叶片或愈伤组织，将其在液氮中充分研磨成粉状；⑵取粉末置于加有裂解液1的离心管中，粉末与裂解液1的比例g：μL为1：8000，涡旋混匀，60‑70℃温育8‑15min，期间上下颠倒混匀2‑3次；所述裂解液1的组成成分及比例如下：100mM pH 8.0Tris‑HCl；25m MEDTA；2M NaCl；质量终浓度为2％的CTAB；质量终浓度为2％的PVP；质量终浓度为0.5％的spermidine；体积终浓度为2％的β‑mercaptoethanol；⑶再加入三氯甲烷，三氯甲烷与裂解液1的体积比为1：1，涡旋混匀，室温放置5min；⑷13000rpm 4℃离心10min；⑸吸上清于新的离心管中，加入上清体积1/5的三氯甲烷，涡旋混匀，室温放置5‑10min；⑹10000‑13000rpm 4℃离心13‑18min，吸上清于新的离心管中，加入上清两倍体积的异丙醇，轻柔混匀；⑺10000‑13000rpm 4℃离心13‑18min,弃上清，得沉淀；⑻加入17μLRNase‑Free Water于离心管中，加入10×DNase I缓冲液2μL，Dnase I 1μL，37℃温浴10‑20min；⑼加入总体积两倍体积的异丙醇，10000‑13000rpm 4℃离心13‑18min，弃上清，使用质量分数为80％的乙醇清洗沉淀2‑3次；⑽待乙醇完全挥发后，加入30‑50μLRNase‑Free Water，即得总RNA，将总RNA立即电泳检测，检测质量合格后，备用；(二)反转录(A)反转录的总RNA质量为1μg，体系为10μL，内参基因的反转录为polyA加尾法，miR156反转录为颈环引物法，引物如下：⑴内参基因反转录体系：⑵miR156反转录体系：(B)将混合物进行70‑80℃、5‑8min预变性，完成后取出置于冰上；待其冷却后，迅速离心，转速500‑3000r/min，离心20s，，将液体全部收集于管底；(C)配制反转录体系，向每个样品加入以下10μL：(D)设置反转录程序，包括退火、延伸、逆转录酶失活三步：该程序完成后，得到完整cDNA；(三)qRT‑PCR检测：(A)试剂：SYBR Green混合液；(B)仪器：定量PCR仪；(C)2个内参基因，1个目的基因，引物如下：Malus×domesticaactin‑FGTCCGTGGAGAAGAGTTACMalus×domesticaactin‑RATGGATGGCTGGAAGAGG18SrRNA‑FATAAACGATGCCGACCAG18SrRNA‑RCCTTGCGACCATACTCCCmiR156‑FAGAAGACAGTGGGTCGACCTCACAmiR156‑RAACTGGTGTCGTGGAG(D)qRT‑PCRR体系，将cDNA模板稀释2倍使用：(E)反应程序：(四)对qRT‑PCR获得的数据进行2－△△Ct法分析，在excel表中作柱状图，得到目的基因新疆野苹果miR156的相对表达量。