[发明专利]一种蔗糖异构酶的固定化方法

摘要

本发明公开了一种蔗糖异构酶的固定化方法，属于生物工程技术领域。本发明以重组短小芽孢杆菌为生产菌株，生产蔗糖异构酶，然后进行固定化，固定化后的酶活为35.2U/g，酶活力回收率达70.3％。固定化酶的最适温度为40℃(游离酶为30℃)，最适pH为4.5(游离酶为6.0)，表明固定化酶具有更好的温度、pH耐受性。以600g·L^‑1的蔗糖浓度为底物，异麦芽酮糖最大产物得率可以达到87.8％。在最佳的转化条件下连续转化16次，产物得率仍有87.52％，显示该固定化酶具有良好的操作稳定性及较高的异麦芽酮糖合成能力。该固定化方法操作简单易行，成本低廉，为工业化应用提供参考。

主权项

1.一种应用短小芽孢杆菌基因工程菌生产蔗糖异构酶的方法，其特征在于，以短小芽孢杆菌基因工程菌B.brevis/pNY 326‑pal I^LSP为生产菌株，在种子培养基中37℃、200rpm，培养10h，转接到发酵培养基中发酵产蔗糖异构酶，培养条件为30℃、200rpm，发酵时间48h；所述短小芽孢杆菌基因工程菌B.brevis/pNY 326‑pal I^LSP构建步骤如下：(1)在如SEQ ID NO.1所示的蔗糖异构酶基因的5’和3’端，设计并引入酶切位点Nde I和Hind III，连接pUC57得到pUC57‑pal I；(2)将携带pal I的质粒pUC57‑pal I和表达载体pET‑24a(+)分别用限制性内切酶Nde I和HindIII进行酶切，回收目的片段连接得到重组质粒pET‑24a(+)‑pal I；(3)以pET‑24a(+)‑pal I为模板，采用一步PCR法对蔗糖异构酶G1347位点进行定点突变，通过突变去掉pal I内部的pst I位点；再扩增获取去除信号肽的具有Pst I和HindIII酶切位点的目的基因片段pal I^LSP；(4)将具有pst I和HindIII酶切位点的去信号肽pal I^LSP，与短小芽孢杆菌表达载体pNY 326进行连接，得到表达质粒pNY 326‑pal I^LSP，将质粒转化短小芽孢杆菌表达宿主，构建得到重组菌B.brevis/pNY 326‑pal I^LSP；所述种子培养基成分按g/L计为：多聚蛋白胨10，酵母粉2，牛肉浸出物5，葡萄糖10，七水硫酸亚铁0.01，四水硫酸锰0.01，七水硫酸锌0.001，pH7.0；所述发酵培养基成分按g/L计为：牛肉蛋白胨10，大豆蛋白胨5，硫代甜菜碱2.4，三水磷酸氢二钾4.56，磷酸二氢钾2.72，七水硫酸亚铁0.01，四水硫酸锰0.01，七水硫酸锌0.001，葡萄糖10，pH7.0。