[发明专利]一种罗格列酮抑制大鼠肝星状细胞活化的研究方法

摘要

本发明公开了一种罗格列酮抑制大鼠肝星状细胞活化的研究方法，分别采用RT‑PCR法检测PDGF mRNA的表达以及采用Western blot方法检测MEK1/2、ERK1/2的蛋白表达情况。通过本发明证实脂联素具有抑制肝纤维化的作用，其机制与PPARγ的转录与调控有关，通过提高PPARγ与脂联素的表达，从而减少I型胶原、MMP2的表达，提高TIMP2的表达，减少细胞外基质的生成及正常内皮下基质的降解，达到阻断肝纤维化进展的目的。

主权项

一种罗格列酮抑制大鼠肝星状细胞活化的研究方法，其特征在于，步骤如下：(1)采用RT‑PCR法检测PDGF mRNA的表达11)样品处理：收获HSC‑T6细胞，移入离心管中，加入Trizol，混匀，室温静置4～6min；加入氯仿，振荡12～18s，静置23min，4℃下离心，12000g×15min，取上清，加入异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置8～12min；4℃下离心，12000g×10min，弃上清；加入体积分数为75％的乙醇，轻轻洗涤沉淀；4℃下离心，7500g×5min，弃上清；晾干，加入55℃的DEPC水溶解10～15min；12)扩增PCR：反应体系为50μL，5×buffer10μL，0.5μL的20μmol/L的α‑SMA引物，TAKARA Ex Taq HS酶0.25μL，用水补至40μL加入第一步反应后液体10μL；用PCR仪扩增，PCR反应条件：PPARγ及β‑actin为：94℃5min，94℃预变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min；Adiponectin为：94℃5min，94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min；13)PDGF表达半定量分析：将PCR反应产物分别在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，得到PPARγmRNA及Adiponectin mRNA的扩增产物，用凝胶成像系统对条带进行光密度扫描，以PDGF/β‑actin的比值为PDGFmRNA的相对表达水平，实验重复5次；其中，设置β‑actin为参照；(2)采用Western blot方法检测MEK1/2、ERK1/2的蛋白表达情况21)细胞中总蛋白的提取a)溶解Western及IP细胞裂解液，混匀，在使用前加入PMSF，使PMSF的最终浓度为0.9～1.1mM；b)对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍，按照6孔板每孔加入100～200μL裂解液的比例加入裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，裂解液接触细胞1～2s后，细胞就会被裂解；c)充分裂解后，以10000～14000转/min的转速离心3～5min，取上清；22)Western blot方法操作a)聚丙烯酰胺凝胶的配制，根据MEK1/2、ERK1/2蛋白分子的大小，配置相应浓度的分离胶和积层胶；b)样品处理：将样品加入等量的4×SDS上样缓冲液，100℃加热3～5min，离心12000g×1min，每组取等量的总蛋白上样，10％SDS‑PAGE分离蛋白质；c)加样：依次加入待分析样品，每孔15～25μL；d)电泳：加样完毕，选择50～70V的电压进行电泳3.5～4.5h，直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳；e)转膜：蛋白质经SDS‑PAGE分离后，从凝胶中转移到固相支持物上PVDF膜，电泳槽加满预冷电转印液，插入电转印夹，4℃，100V，200mA，2h；f)膜的封闭：漂洗转印膜，室温，3次×15min，以尽量洗去转印膜上的SDS，放入质量分数为5％脱脂奶封闭液内，摇床震动，室温封闭1h；g)抗体杂交：(1)封闭后pvdf膜放入杂交袋中，加入适当稀释的一抗，4℃孵育过夜1xTBS‑T，pH7.6洗液洗膜3次×10min；(2)过氧化物酶标记山羊大鼠二抗孵育4h，1xTBS‑T洗膜3次×15min；h)显色、显影、定影：ECM显色剂后曝光，将曝光后的X感光胶片放入显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止，再放入定影液中定影，胶片长期保存；用Umax2100XL扫描仪以及凝胶分析软件Bandscan5.0分析目标带的分子量和灰度值，以MEK1/2、ERK1/2与对应的内参β‑actin蛋白灰度值相比，计算二者灰度比值。