[发明专利]制备干细胞活性因子的方法

摘要

本发明涉及制备干细胞活性因子的方法。具体地说，本发明一方面涉及一种制备干细胞活性因子的方法，该方法其包括以下步骤：(1)脐带源间充质干细胞获取；(2)细胞扩增；(3)细胞鉴定检测；(4)干细胞活性因子的制备；(5)任选的冷冻干燥。进一步的，本发明还涉及示例性的通过本发明方法制备得到的干细胞活性因子冻干粉剂。本发明方法具有如本发明说明书所述有益效果。

主权项

制备干细胞活性因子的方法，其包括以下步骤：(1)脐带源间充质干细胞获取：取健康足月剖宫产孕妇脐带，通过分离华通氏胶(Wharton's Jelly)法，使用华通氏胶悬浮法制备；将华通氏胶放于T75培养瓶，加入适量间充质干细胞(MSC)无血清培养基，置于37℃，5％的CO2培养箱内培养，培养7天以后出现细胞集落；约10‑13天细胞达到饱和，可进行传代；细胞呈长梭形，是典型的成纤维细胞样形态；(2)细胞扩增：当细胞融合度达70‑80％时，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶细胞1‑2次，添加3‑5ml消化液，室温放置1‑2分钟，镜下观察细胞接近球形，轻轻拍打瓶壁，中止消化，转移至离心管混匀，取样计数，按照8000个细胞/cm2进行传代，2‑3天细胞密度达70‑80％时，反复以上操作，以获得足够量的MSC，一般采用P3‑P5代细胞制备；(3)细胞鉴定检测：细胞活率达90％以上时，流式检测标志物合格；(4)干细胞活性因子的制备：4i)细胞培养至最旺盛时，收集上清至离心管，0.22μm滤膜过滤上清除菌；4ii)用生理盐水清洗2‑3次培养瓶，弃去，然后采用细胞饥饿法加入10ml生理盐水/T225培养瓶继续培养12‑24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400rpm，离心5min，收集的上清，经0.22μm滤膜过滤除菌；4iii)将步骤4i)和4ii)的上清混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液。