[发明专利]一种稻绿核菌产五种稻曲病菌毒素的方法

摘要

本发明涉及一种稻绿核菌产五种稻曲病菌毒素的方法，包括取培养15d的大米培养基进行提取毒素提取。所述稻绿核菌为稻绿核菌(Ustilaginoidea virens）ZZY‑2，通过采集源的分离和纯化后获得，已于2016年4月26日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保存中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO：M2016230。

主权项

一种产五种稻曲病菌毒素的稻绿核菌，保藏号为CCTCC NO：M2016230，通过如下方法获得：将采集的稻曲球病粒先用75％酒精浸泡10秒钟，然后放于酒精灯上自燃5秒钟，用无菌滤纸吸干表面的水分，将表层的组织在无菌操作状态下清理干净，然后用无菌手术刀将稻曲球切开，夹取中间层，接种到含终浓度为0.05g/L氯霉素的无菌PSA平板培养基上，每皿接种3个点，每一样品设3个重复，接种后的培养皿于28℃恒温培养箱培养，待菌落长出后(3‑5d)，用尖头挑针挑取黄色或白色小菌落或者挑取边缘的菌丝移至新鲜配制且已灭菌的PSA平板培养基中，进行反复纯化；将纯化后的菌株接种到新鲜配制的无菌PSA平板上进行活化，活化后的菌株接种于50mL PS的250mL三角瓶种，置于150r/min、28℃恒温摇床中培养7‑10天，即得到菌丝孢子混合液；将此混合液经四层纱布过滤后所得滤液，即为薄壁分生孢子液；采用250mL锥形瓶装有50mL马铃薯蔗糖培养基，将培养的孢子接入其中，调节孢子数量为1×106个/瓶，置于150r/min、28℃恒温摇床中培养15d，每组设3个重复，将培养15d的PS培养液混匀后离心收集上清液，取10mL上清液加入等体积二氯甲烷充分振摇，于7000r/min下离心15min，使其分层，再次收集上清液，将其配成2mL 5％甲酸样品粗提液作为待净化液，采用PCX小柱进行净化，优化得到以含5％甲酸为最佳上柱环境和5％氨水甲醇溶液为洗脱剂的净化条件，根据液体培养液中毒素的含量筛选出产毒素最高的一株稻曲病菌菌株。