[发明专利]一种用黄素荧光蛋白锚定并优化制备甲基对氧硫磷水解酶的方法

摘要

本发明提出了一利用黄素荧光蛋白锚定并优化展示甲基对氧硫磷水解酶的方法。其步骤为：1)构建融合基因(H6MPH‑EcFbFP)；2)构建重组质粒pET23a/H6MPH‑EcFbFP，同时将通过PCR将带电荷多肽6×Glu的编码序列引入融合蛋白(H6MPH‑EcFbFP)编码基因的3’端，并构建重组质粒pET23a/H6MPH‑EcFbFP(E6)；3)重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，获得基因工程菌株；4)将重组菌株摇瓶培养，并分别提取细胞各组份，检测表面展示效率；5)测量甲基对氧硫磷水解酶的酶活；6)对MPH表面展示的稳定性进行测量。本发明首次以黄素荧光蛋白(EcFbFP)作为锚定蛋白，将MPH在大肠杆菌中表面展示，展示效率高，制备的MPH酶活稳定性好。

主权项

一利用黄素荧光蛋白锚定并优化展示甲基对氧硫磷水解酶的方法，其特征在于步骤为：1)重组质粒构建。首先，设计构建融合基因H6MPH‑EcFbFP；其次，将融合基因(H6MPH‑EcFbFP)克隆到表达载体pET23a‑T，构建重组表达质粒pET23a/H6MPH‑EcFbFP；然后，设计PCR引物携带编码负电荷多肽6×Glu的基因序列，通过PCR引入重组质粒pET23a/H6MPH‑EcFbFP，重新构建重组表达质粒pET23a/H6MPH‑EcFbFP(E6)；2)重组菌株构建。将构建好的两种重组质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta Blue感受态细胞，并涂布于LA平板，37℃静置培养16h，获得重组菌株；3)重组菌株培养和表达。接种重组菌株于氨苄青霉素浓度100μg/mL的LB培养基中诱导培养，培养条件为：首先，37℃200RPM震荡培养，在OD值为0.5～0.6之间，加入IPTG，终浓度为1mM，37℃继续诱导培养8小时；然后，12000RPM，4℃，10分钟离心收集菌体，菌体用预冷PBS清洗3次，重悬于10mL的预PBS中备用；4)细胞组份提取。取1mL菌液，12000RPM，4℃，离心2分钟收集菌体，将菌体重悬于1mL预冷的TES缓冲液中，静置5分钟，12000RPM，离心10分钟，离心后的上清定义为细胞外膜组份；将沉淀重悬于1mL预冷的MgCl2缓冲液中，4℃静置30分钟，12000RPM，离心10分钟，离心后的上清定义为细胞周质组份；将沉淀重悬于1mL预冷的PBS缓冲液之中，定义为细胞胞质组份；5)细胞表面展示效率测定。分别取200μL步骤4中的上述各细胞组份，用SDS‑PAGE检测。经考马斯亮蓝染色之后，采用灰度扫描的方法来计算各组份中的目的蛋白占总目的蛋白的比例，以此来计算出MPH的展示效率；6)细胞表面展示MPH活性测定。按照文献[1]方法对细胞表面展示MPH进行活性测定。7)展示MPH稳定性测定。参照步骤6中的方法，每天在相同的时间内对同一份样品进行酶活测定，连续测量31天，并绘制酶活的变化趋势。